[发明专利]一种双标记报告荧光多重病原体核酸检测方法

说明书

本发明涉及一种双标记报告荧光多重病原体核酸检测方法，本发明在现有技术的基础上设计出包括两种荧光基团，以及一种或两种淬灭荧光基团标记的探针，并使用该探针检测核酸，所述被检测核酸选自病原体，本发明所述探针包括两种荧光基团，称为双标记的报告荧光，所述报告荧光选自FAM、HEX/VIC/HEX/、TAMRA、Cy3、Cy5、CY5.5、Texax、ROX，本发明所述探针包括淬灭荧光，选自BHQ1、BHQ2与BHQ3。

技术领域：

本发明涉及核酸的检测，特别涉及病毒、细菌等病原体核酸的检测，本发明进一步涉及一种双标记报告荧光多重病原体核酸检测方法。

背景技术：

核酸检测，即核酸扩增检测技术泛指以扩增DNA或RNA为手段，从而筛查特定基因的检测技术，如聚合酶链反应(PCR)、连接酶链反应(LCR)、转录依赖的扩增反应(TMA)等。核酸检测试剂是基于核酸扩增检测技术的体外诊断试剂，目前已经用于病原体检测、特定疾病的早期诊断和体内物质的型别鉴定等。

已有的多病原核酸检测技术主要是基于扩增片段大小通过琼脂糖凝胶电泳检测或者基于荧光PCR原理单荧光标记技术检测的多重PCR技术。基于扩增片段大小通过琼脂糖凝胶电泳检测的多重PCR技术耗时，容易造成污染；基于荧光PCR原理单荧光标记技术同一反应管中最多检测4种病原，如果检测5种以上多病原需要配制多管反应液，浪费时间、试剂与模板。

本发明主要是为了解决检测多病原需要配几个反应液或需要电泳检测而造成的耗时耗力并容易产生交叉污染的问题。

本发明涉及核酸扩增，具体是一种基于双荧光探针标记判断一种病原的多重PCR方法及其应用。本发明基于荧光PCR技术原理，通过每个病原由双标记报告荧光判读结果而开发的一系列多病原核酸检测方法。

发明内容

PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5'-3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。常用的荧光基团是FAM，TET，VIC，HEX。引起荧光熄灭的物质称为荧光熄灭剂。如，卤素离子、重金属离子、氧分子以及硝基化合物、重氮化合物、羧基和羰基化合物均为常见的荧光熄灭剂。

本发明在于，在现有技术的基础上设计出包括两种荧光基团，以及一种或两种淬灭荧光基团标记的探针，并使用该探针检测核酸。

所述被检测核酸选自病原体，如常见的人与动物传染病如呼吸道病原体、发热伴出疹病原体、感染性腹泻及食源重要病原体、虫媒传染病、人畜共患病原体、肝炎病毒、烈性传染病病原体等。

所述病原体优选包括呼吸道病原体，如：(甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、人副流感病毒、腺病毒、偏肺病毒、博卡病毒、冠状病毒、鼻病毒、肠道病毒、肺炎支原体、肺炎衣原体、肺炎链球菌、流行性脑膜炎双球菌、军团菌、百日咳、副百日咳、结核分枝杆菌等病毒细菌及其亚型)。发热伴出疹病原体(肠道病毒、风疹病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、疱疹病毒、伤寒副伤寒、细小病毒、巨细胞病毒、立克次体等病毒细菌及亚型)、感染性腹泻及食源重要病原体(诺如病毒、札如病毒、轮状病毒、星状病毒、霍乱弧菌、致泻性大肠埃希菌、副溶血弧菌、弯曲曲、志贺氏菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、芽孢杆菌、假单胞菌等病毒细菌及其亚型)、虫媒传染病(布尼亚病毒、登革热病毒、黄热病毒、西尼罗病毒、寨卡病毒、基孔肯雅热病毒、疟原虫等病毒细菌及其亚型)、人畜共患病原体、肝炎病毒(甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、人类免疫缺陷病毒等)、动物传染病原体(口蹄疫、猪瘟、伪狂犬、乙脑、猪细小、布鲁菌病、链球菌病、附红体病、猪肺疫、猪副伤寒、猪大肠杆菌病、狂犬病、蓝耳病、猪流感、猪痢疾、猪丹毒、猪喘气病、猪痘等)。