[发明专利]一种依赖NHEJ的报告基因敲入组合物及其使用方法

说明书

本发明涉及一种依赖NHEJ的用于报告基因敲入的组合物，含以下组分：通用型报告基因敲入载体T‑sgX‑PAM‑IRES‑EGFP‑polyA；通用型sgRNA/Cas9质粒PX459‑sgX；任选的，包含待敲入位点信息的sgRNA/Cas9质粒。本发明具有如下有益效果：1)该组合物可以比传统的依赖HDR的敲入方式更为高效地完成报告基因的敲入；2)敲入载体可以通用，而不用像HDR方式换个待敲入位点就需要更换同源臂重新构建敲入载体。

技术领域

本发明涉及基因编辑技术领域，尤其涉及一种高效地将外源基因导入哺乳动物基因组指定位点的依赖NHEJ的报告基因敲入组合物及其使用方法。

背景技术

基因组编辑技术是一种可以对生物体基因组完成精确修饰的一种技术，利用基因组编辑技术可以将细胞内特定的基因进行敲除、敲入和突变等，从而改变生物体的遗传特性。目前基因组编辑的基本原理是利用某些方法在基因组特定的靶位点区诱发DNA双链缺口(double-strain break，DSB)，从而激活细胞内的DNA损伤修复机制来进行基因组的改造。细胞内主要修复DNA双链缺口的机制有两条：一条是非同源区的末端连接途径(Non-homologous End Joining，NHEJ)，在该途径中细胞对DNA断裂处进行部分酶切，使之产生粘性末端，再将两个末端连接起来，这个过程中往往会形成小片段的插入或缺失，因此使得该相应基因有几个氨基酸的增减或发生移码突变而被敲除。另一条重要的修复途径是同源重组修复途径(Homology directed repair，HDR)，若DNA损伤时的同时恰好遇到与该损伤位点同源性很高的另一条完整DNA时，损伤位点会以同源的DNA为模板进行操作修复，若同源基因中被人为引入了其它基因、元件或者点突变则可凭此修改细胞基因组。因此以HDR方式对基因组DNA进行修复具有更高的可控性，可以完全产生预期的基因组改变，并且能够在适当的位置引入特定的外源基因。例如可以在基因组特定基因后面加上报告基因，可以实时监测基因的表达调控情况以研究相应功能。

在细胞内，DSB产生基因组破坏所诱发的修复反应主要以NHEJ修复为主，虽然DSB可以极大的提高同源重组的概率，但依赖HDR介导的基因敲入效率仍是极低。最近Merkle等的研究报道，在没有筛选前提下，CRISPR/Cas9介导的依赖于HDR的基因敲入效率大概只有1X10^-5左右，这使得后期的筛选鉴定工作变得极为困难。并且利用HDR方式进行基因敲入时，每次都需要根据欲改造基因信息，构建插入基因两端含有同源臂的打靶载体。此外，有研究报道，在HDR介导的基因敲入过程中，研究者在混合细胞中能检测到部分细胞只有一条同源臂发生了同源重组，而打靶载体的另一端与非序列特异的方式插入基因组中。同时还有研究表明，外源基因可以不依赖于HDR的方式插入基因组的特定位置。最近还有研究证明，平末端的硫代寡聚脱氧核苷酸可以依赖于NHEJ修复途径高效地插入基因组DSB位置。这些都提示外源基因有可能可以以依赖NHEJ的方式更为高效地插入到基因组的特定位置。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种依赖NHEJ的用于报告基因敲入的组合物及其使用方法，并且以该组合物可以比依赖HDR的敲入方式更为高效地完成报告基因的敲入，而且敲入载体可以通用，不用像HDR方式换个敲入位点就需要重新换同源臂构建敲入载体。

为了达到上述的目的，本发明提供了一种依赖NHEJ的用于报告基因敲入的组合物，所述组合物包含以下组分：

通用型报告基因敲入载体T-sgX-PAM-IRES-EGFP-polyA；

通用型sgRNA/Cas9质粒PX459-sgX。

进一步地，其中所述通用型报告基因敲入载体T-sgX-PAM-IRES-EGFP-polyA的主要元件包含通用型sgRNA的PAM识别序列、IRES序列、报告基因编码序列和转录终止信号。

进一步地，其中所述的组合物还包含待敲入位点信息的sgRNA/Cas9质粒。