[发明专利]一种基于核糖体ITS2基因分析等边浅蛤遗传结构的方法在审
| 申请号： | 201910973784.9 | 申请日： | 2019-10-14 |
| 公开（公告）号： | CN110714062A | 公开（公告）日： | 2020-01-21 |
| 发明（设计）人： | 叶莹莹;杨槐;郭亚红 | 申请（专利权）人： | 浙江海洋大学 |
| 主分类号： | C12Q1/6869 | 分类号： | C12Q1/6869 |
| 代理公司： | 33109 杭州杭诚专利事务所有限公司 | 代理人： | 尉伟敏 |
| 地址： | 316022 浙江省*** | 国省代码： | 浙江;33 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 遗传结构 基因分析 核糖体 测序 遗传多样性参数 资源开发与保护 凝胶成像系统 遗传结构分析 琼脂糖凝胶 冰冻保存 电泳检测 理论数据 苗种培育 重要理论 闭壳肌 核基因 比对 引物 校正 拍照 育种 养殖 观察 分析 研究 | ||
1.一种基于核糖体ITS2基因分析等边浅蛤遗传结构的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）样品采集：取浅蛤闭壳肌，将其冰冻保存；
（2）DNA提取：取闭壳肌组织剪碎后置于放有裂解液的容器中，随后加入Protein K酶，翻转后恒温保存；随后加入NaCl溶液，充分涡旋并离心后，取上清液，加入异丙醇，翻转后冷冻存放；随后离心洗涤，取出烘干，加入水，用琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量；
（3）PCR扩增及测序：使用核基因ITS引物，采用25μL 反应体系进行PCR扩增，随后将PCR产物在琼脂糖凝胶上进行电泳检测，凝胶成像系统拍照观察；最后将扩增结果纯化测序；
（4）结果分析：对测序结果进行比对校正，得到遗传多样性参数并计算，分析等边浅蛤遗传结构。
2.根据权利要求1所述的一种基于核糖体ITS2基因分析等边浅蛤遗传结构的方法，其特征在于，步骤（2）样品采集时取2个及以上的群体，每个群体25-30尾。
3.根据权利要求1所述的一种基于核糖体ITS2基因分析等边浅蛤遗传结构的方法，其特征在于，步骤（2）中各物质添加量为：闭壳肌组织15-20mg；裂解液400-450μL；Protein K酶10-15μl；NaCl溶液浓度为6mol/L，300-350μL；异丙醇与上清液的体积比为1:0.8-1.2；水50-60ul。
4.根据权利要求1所述的一种基于核糖体ITS2基因分析等边浅蛤遗传结构的方法，其特征在于，步骤（2）中所述恒温保存为在50-60℃下水浴10-18h；所述冷冻存放为在-30~-20℃下放置1-2h。
5.根据权利要求1所述的一种基于核糖体ITS2基因分析等边浅蛤遗传结构的方法，其特征在于，所述离心洗涤步骤为将冷冻存放后产物置于4℃下离心5-10min，转速为10000 -12000rcf，取出缓慢倾倒，弃上清液，加入1-1.5ml 70%乙醇，再置于4℃下离心5-10min，转速为10000 -12000rcf。
6.根据权利要求1所述的一种基于核糖体ITS2基因分析等边浅蛤遗传结构的方法，其特征在于，所述烘干条件为在45℃-55℃的烘箱中烘1-10h。
7.根据权利要求1所述的一种基于核糖体ITS2基因分析等边浅蛤遗传结构的方法，其特征在于，所述25μL 反应体系包括10Xbuffer 3.76μL，dNTP mix1μL，前、后引物分别1μL，DNA模板1μL，rTaq酶0.5μL，余量为水。
8.根据权利要求7所述的一种基于核糖体ITS2基因分析等边浅蛤遗传结构的方法，其特征在于，所述前引物为ITS3：5'-GCATCGATGAAGAACGCAGC- 3'，后引物为ITS28：5'-CGCCGTTACTAGGGGAATCCTTGTAAG- 3'。
9.根据权利要求1所述的一种基于核糖体ITS2基因分析等边浅蛤遗传结构的方法，其特征在于，步骤（3）中所述PCR扩增条件：94℃预变性3min，94℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸1min，共32个循环，最后72℃延伸7 min。
10.根据权利要求1所述的一种基于核糖体ITS2基因分析等边浅蛤遗传结构的方法，其特征在于，所述遗传多样性参数包括：多态位点数、单倍型数、核苷酸多样性（P）、单倍型多样性和平均核苷酸差异数。
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