[发明专利]一种质谱探针在SGK1蛋白活性检测中的应用

说明书

发明公开了一种质谱探针在SGK1蛋白活性检测以及在筛选SGK1蛋白抑制剂中的应用。该质谱探针是氨基酸序列为Cys‑Lys‑Arg‑Pro‑Arg‑Ala‑Ala‑Ser‑Phe‑Ala‑Glu的多肽。本发明提供的质谱探针不仅能被SGK1磷酸化，生成磷酸化产物，同时具有较高的质谱响应，质谱检测准确度高，能够准确反应SGK1的活性，可用于检测SGK1蛋白活性，还可以用于筛选SGK1抑制剂。

技术领域

本发明属于药物筛选与评价方法领域，具体涉及一种质谱探针在SGK1蛋白活性检测中的应用。

背景技术

血清和糖皮质激素诱导的蛋白激酶1(serum glucocorticoid-induciblekinase1，SGK1)，是丝氨酸/苏氨酸激酶家族成员之一，是AKT的同源异构体。SGK1在许多物种中都有表达，哺乳动物中几乎所有组织都有表达SGK1，但表达水平差异很大。SGK1在大多数细胞中表达含量较低，但在一定的病理生理条件下，如糖皮质激素或盐皮质激素过量、TGF-β释放引起的炎症、高血糖、细胞收缩和缺血等，SGK1的表达显著升高。

SGK1刺激多种肾小管离子通道和转运体，参与调节肾电解质排泄，其对肾盐排泄和盐摄入量的影响有望影响血压控制。近年来发现SGK1蛋白活性与如高血压、肥胖、心血管疾病、代谢综合症等疾病的发生发展密切相关。过多的SGK1表达和活性会导致多种疾病的病理生理学，包括高血压、肥胖、糖尿病、血栓形成、中风、纤维化疾病、不孕和肿瘤生长等。SGK1蛋白抑制剂EMD638683被认为在包括代谢综合征和肿瘤生长方面发挥重要功能，在临床靶向治疗中显示一定的治疗前景，如申请号为CN201410535640.2的专利申请文献以及“Sgk1-Dependent Stimulation of Cardiac Na+/H+Exchanger Nhe1 by Dexamethasone”均公开了一种新型SGK1抑制剂EMD638683在制备治疗急性心肌梗死药物中的应用。

现有的SGK1抑制剂筛选方法主要包括计算机辅助药物发现(CADD)、荧光偏振、Elisa法等。目前关于用质谱探针检测SGK1活性的实例尚未有报道，质谱探针具有专属性高，灵敏度高等优点。

发明内容

本发明的目的在于提供一种高质谱响应的质谱探针的应用，其作为酶底物，被SGK1识别，再通过质谱测定磷酸化反应前后磷酸化产物的量来用于检测SGK1的活性，进一步用于筛选SGK1蛋白抑制剂。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明提供了一种质谱探针在SGK1蛋白活性检测试剂中的应用，所述质谱探针为氨基酸序列为Cys-Lys-Arg-Pro-Arg-Ala-Ala-Ser-Phe-Ala-Glu的多肽。

本发明还提供了上述质谱探针在筛选SGK1蛋白抑制剂中的应用。

上述质谱探针由可被SGK1识别的多肽组成，所述多肽的氨基酸序列为：半胱氨酸-赖氨酸-精氨酸-脯氨酸-精氨酸-丙氨酸-丙氨酸-丝氨酸-苯丙氨酸-丙氨酸-谷氨酸(SEQID NO.1)。

SGK1磷酸化位点为丙氨酸与苯丙氨酸之间的丝氨酸，因此，上述质谱探针的磷酸化产物为Cys-Lys-Arg-Pro-Arg-Ala-Ala-p-Ser-Phe-Ala-Glu，其中p为磷酸化基团。因此通过测定反应前后磷酸化产物的量，即可检测SGK1的活性，因此，可用于筛选SGK1蛋白抑制剂。

所述质谱探针的结构如下式(Ⅰ)所示：

上述质谱探针采用固相法合成，具体方法包括：先用二氯甲烷溶涨树脂，依次加入保护氨基酸原料和N,N-二异丙基乙胺反应，反应结束后脱保护；重复上述步骤依次连接氨基酸后制得。