[发明专利]一种高滴度EB病毒的制备方法、EB病毒永生化记忆性B细胞的方法与应用

说明书

本发明公开了一种高滴度EB病毒的制备方法、EB病毒永生化记忆性B细胞的方法与应用，属于人源单克隆抗体领域。本发明在B95.8细胞中加入PMA进行孵育处理，然后培养，离心得高滴度EB病毒。再利用高滴度EB病毒结合辐照的饲养层细胞和CpG共同孵育实现记忆性B细胞的永生化，然后利用永生化记忆性B细胞分泌的抗体快速筛选病原特异性抗体和中和性抗体。实现有针对性的快速筛选、获得有结合活性或有中和活性的全人源单克隆抗体，减少后续无关抗体基因扩增和验证的庞大工作量，而且可以在筛选早期就确定抗体是否有结合活性或中和活性，可以快速集中进行中和抗体的制备，减少了不必要的盲目表达验证，提高了特异性快速筛选抗体的过程。

技术领域

本发明涉及人源单克隆抗体领域，具体地，涉及一种高滴度EB病毒的制备方法、EB病毒永生化记忆性B细胞的方法与应用。

背景技术

机体的免疫反应包括体液免疫和细胞免疫，共同协同发挥作用，抵御病原的入侵；其中体液免疫主要通过抗体-抗原结合识别、抑制病原在体内的复制，而中和性抗体是目前治疗病毒性传染病的重要方法，如呼吸道合胞体病毒(RSV)的商业化抗体帕利珠单抗(Palivizumab,Synagis)是一种人源化鼠抗RSV单克隆中和抗体，抗炭疽杆菌的瑞西巴库单抗(Raxibacumab,ABthrax)是美国食品药品管理局(FDA)批准的全人源抗炭疽芽孢杆菌毒素的单克隆抗体；全人源中和性单克隆抗体是目前临床救治发展最快的药物之一。

目前人源单克隆抗体的制备方法中，有利用鼠源抗体人源化、噬菌体展示文库筛选、酵母展示文库筛选、单细胞RT-PCR等方法；鼠源抗体人源化主要指恒定区和可变区的框架区人源化，制备获得的抗体可变区仍然是针对小鼠的免疫系统，无法做到全人源化，仍有免疫排斥的可能性；噬菌体和酵母展示文库方法都是通过构建庞大的可变区文库，筛选有结合的抗体，但重链轻链的组合是随机的，可能会产生某些机体不存在的抗体组合方式，生物影响未知，另外这种方法筛选工作量较大，针对性不强；单细胞RT-PCR是通过流式分选获得单个特异性可与病原蛋白结合的B细胞，然后提取核酸、扩增、表达抗体。该方法只能通过特异性探针捕捉特异性B细胞，工作量较大，无法在早期筛选时确认中和性抗体，只有抗体表达后才能确认，工作量较大。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种高滴度EB病毒的制备方法、EB病毒永生化记忆性B细胞的方法与应用。

本发明的第一个目的是提供一种高滴度EB病毒及其制备方法；

本发明的第二个目的是提供一种EB病毒永生化记忆性B细胞的方法；

本发明的第三个目的是提供EB病毒永生化记忆性B细胞用于筛选具有结合活性或中和活性的人源单克隆抗体。

本发明的目的通过以下技术方案实现。

一种高滴度EB病毒的制备方法，包括以下步骤：

在经过传代培养的B95.8细胞中加入PMA进行孵育处理，然后继续培养，离心得高滴度EB病毒。

优选的，当B95.8细胞传代培养的浓度为(5～10)×10⁵cell/ml时，加入PMA。

进一步优选的，当B95.8细胞传代培养的浓度为5×10⁵cell/ml时，加入PMA。

优选的，所述PMA是以溶解于乙醇中的方式加入，PMA加入后在培养基中的浓度为5～10ng/ml。

进一步优选的，所述PMA是以溶解于乙醇中的方式加入，PMA加入后在培养基中的浓度为5ng/ml。

优选的，所述孵育处理的时间为12～24h。

进一步优选的，所述孵育处理的时间为24h。

优选的，继续培养的时间为10～15天。