[发明专利]一种长牡蛎EF-1α启动子及其重组载体和应用

权利要求书

1.一种长牡蛎EF-1α启动子，其特征在于，该启动子的序列如SEQ ID NO: 1所示。

2.一种重组表达载体，其特征在于，该载体包含所述序列为SEQ ID NO: 1的核苷酸片段。

3.权利要求2所述的重组表达载体的构建方法，其特征在于，具体步骤如下：

1)根据长牡蛎基因组序列设计长牡蛎EF-1α基因上游启动子特异性扩增引物一对并加质粒同源末端，序列如SEQ ID NO: 2和SEQ ID NO: 3所示；

2)以长牡蛎基因组DNA为模板，PCR扩增，回收产物；

3)酶切质粒，回收产物；

4)将酶切线性化质粒与2)回收PCR产物进行In-Fusion 连接，连接产物导入大肠杆菌感受态细胞，平板筛选，挑取单克隆摇菌培养；

5)提取菌液质粒，进行酶切，根据酶切结果挑选符合预期的质粒进行测序，测序正确的质粒命名为pEGFP-CgEF-1α，即为重组表达载体。

4.如权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述步骤2）中的PCR体系为：5x PhusionHF Buffer，10μl；2.5 mM dNTPs，4μl； 上游引物10uM、2.5μl；下游引物10uM、2.5μl；模板DNA 100ng/μl、1μl；Phusion High-Fidelity DNA Polymerase 0.5μl；超纯水 29.5μl；扩增程序为：98℃ 预变性 30s；98℃变性10s，64℃ 退火30s，72℃ 延伸1min 20s，35个循环；72℃延伸10min。

5.如权利要求4所述的构建方法，其特征在于，步骤3）和5）中的酶切体系为：10xCutSmart Buffer 5 μl，质粒DNA 150ng/μl、 6 μl，BamH Ⅰ 酶20U/μl、0.5μl, 超纯水37.5μl；反应程序为37℃，2h。

6.如权利要求3所述的构建方法，其特征在于，步骤4）中的In-Fusion 连接体系为：5xIn-Fusion HD Enzyme Premix 2μl，线性化pEGFP-1 质粒DNA 43ng/μl、1.5μl，回收产物16ng/μl、6.5μl；反应程序为50℃，15min。

7.如权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述步骤1）中选用质粒pEGFP-1。

8.权利要求1所述的长牡蛎EF-1α启动子在长牡蛎基因育种中的应用。

9.权利要求3所述的重组表达载体的具体应用方法，其特征在于，为利用显微注射方法将所述重组表达载体与酚红混合物导入长牡蛎受精卵，在荧光显微镜下连续观察，在桑葚期、囊胚期、原肠期胚胎，担轮幼虫和D形幼虫各类型细胞中均可观测到绿色荧光，即所述EGFP基因表达。