[发明专利]一种GIV.1型诺如病毒的RT-LAMP法检测用成套引物、试剂盒及检测方法

说明书

本发明涉及一种GIV.1型诺如病毒的RT‑LAMP法检测用成套引物、试剂盒及检测方法。该成套引物包括外引物对GIV‑F3和GIV‑B3，内引物对GIV‑FIP和GIV‑BIP，以及环引物对GIV‑LF和GIV‑LB；其序列如SEQ ID NO:1至6所示。该试剂盒含有该成套引物。该检测方法采用该试剂盒。本发明结果可靠，成本相对较低，具有简单、快速、灵敏的特点，尤其适用于现场即时检测，并适用于国内大多数缺乏实时荧光定量PCR仪的医院、防疫部门实验室使用。

技术领域

本发明涉及一种GIV.1型诺如病毒的RT-LAMP法检测用成套引物、试剂盒及检测方法，属于生物技术领域。

背景技术

诺如病毒(Norovirus，NV)又称诺瓦克病毒，属杯状病毒科，为单股正链RNA病毒，是导致全球急性非细菌性肠胃炎暴发的最主要病原体。该病毒在全球范围内广泛流行，主要通过污染的食物和水源传播，也可通过人-人接触进行传播，经常在医院、学校、军队等人员聚集场所暴发流行。据报道，全球每年有超过1亿人因感染诺如病毒而发病。其临床症状主要为恶心、呕吐、腹痛和腹泻，多数患者表现为自限性，但少数婴幼儿、老人和免疫缺陷患者会发展成重症，甚至死亡。对诺如病毒的快速诊断，对临床诊疗和疾病防控工作具有重要的意义。

根据诺如病毒衣壳蛋白VP1编码序列的不同，可将诺如病毒分为7个基因组(GI～GVII)，其中GI型、GII型和GIV型感染人。GIV型又分为两个基因型，GIV.1型感染人，GIV.2型感染猫类和犬类。

目前大多数对于诺如病毒的检测主要集中于人类感染常见的GI型和GII型，且以血清学，如ELISA等技术手段为主。GIV.1型诺如病毒在全球中整体流行情况未知，通常在散发病例和环境中被检测出，检测率相对低下，也反映出缺乏特异、灵敏的检测方法。

环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是由Notomi在2000年开发的一种恒温核酸扩增技术；LAMP方法针对靶基因的8个基因片段设计3对特异性引物，依赖链置换型DNA酶(Bst DNA polymerase)在60℃～65℃等温条件下1h内实现靶基因高效率扩增，扩增时形成肉眼可见的焦磷酸沉淀，能根据沉淀判定阳性反应；其操作方便、特异性强、灵敏度高，无需PCR仪等昂贵设备，只需一个水浴锅或恒温金属浴。且可在反应体系中加入镁离子指示剂羟基萘酚蓝(hydroxy naphthol blue，HNB)，通过扩增过程消耗镁离子后颜色发生变化来进行结果判断，显示蓝色为阳性反应，而紫色为阴性反应，直接目测观察结果，避免开盖跑胶等所造成的气溶胶污染，适用于现场检测及缺乏PCR仪等设备的基层医院检验科。

经检索发现，申请号CN200710030430.8、授权公告号CN101153341B的中国发明专利，公开了一种基于环介导等温扩增技术的食源性病原体快速检测技术，其中涉及诺如病毒GII型检测用引物，能扩增靶基因的特异碱基序列，靶基因为诺如病毒GII型的衣壳蛋白---GenBank登陆号：X86557，引物与所述靶基因的5095位---5319位的核酸序列的一部分或其互补链互补。该技术方案利用包含有上述引物组的试剂盒检测标本中是否存在诺如病毒GII型特定基因片段，进而确定标本中是否存在诺如病毒GII型。然而，该技术方案仅针对GII型诺如病毒，并非针对GIV型诺如病毒，无法直接适用。

申请号CN201310690315.9、授权公告号CN103642943B的中国发明专利，公开了一种GⅠ型诺如病毒的环介导等温扩增检测引物组、检测方法和试剂盒。检测引物组包括上游外引物F3、下游外引物B3、上游内引物FIP、下游内引物BIP，具体序列见其原文。该技术方案建立了GⅠ型诺如病毒的LAMP检测方法，该检测方法针对GⅠ型诺如病毒的RNA多聚酶基因，设计和筛选了一套特异性引物(4条引物)，包括两个特异性内引物和两个特异性外引物。然而，该技术方案仅针对GI型诺如病毒，并非针对GIV型诺如病毒，无法直接适用。