[发明专利]一种高特异性甲磺隆多克隆抗体的制备方法

权利要求书

1.一种高特异性甲磺隆多克隆抗体的制备方法，其特征在于：包括如下步骤；

1)甲磺隆半抗原的制备：

称取1.25～1.35g邻甲酯苯磺酰胺和0.5～0.7g琥珀酸酐加入干燥的圆底烧瓶中，向其中加入15～20ml二恶烷，使其完全溶解，制成A液。再称取1.80～1.85g 1，8-二氮杂双环[5.4.0]十一-7-烯，加入5～10ml二恶烷使其完全溶解，制成B液；将B液在30min内逐滴加入到A液中，此过程中A液在常温下匀速搅拌；B液全部滴加入到A液中后，将混合物在21～23℃条件下匀速搅拌2～2.5小时，反应停止后用15～20ml 2mol/L的盐酸酸化，将混合物在50～52℃下进行旋转减压蒸馏，旋蒸得到的物质用乙酸乙酯进行萃取，收集有机相；将收集的有机相在35℃下进行旋转减压蒸馏，用1～3mL展开剂将蒸馏得到的物质溶解，点样于薄层板上，一般为圆点，点样基线距底边1.0～1.5cm，样品点直径一般不大于2mm，点间距离可视斑点扩散情况决定，将点连成线即可；点样时必须注意勿损伤薄层表面；将点好样品的薄层板放入展开缸的展开剂中，浸入展开剂的深度为距原点5mm为宜，密闭，待展开至距离另一底边2～3cm即可，取出薄层板，晾干，在暗箱三用紫外线分析仪254nm下观察，将需要的条带刮下来，收集所有薄层板的硅胶沙，将收集的硅胶沙浸泡于乙酸乙酯中，涡旋震荡，离心，取有机相，用0.22μm的有机膜将有机相过滤，重复洗涤3～5遍；收集有机相进行35～40℃旋转减压蒸发，收集沉淀，进行真空干燥；得到的物质即为甲磺隆半抗原；

2)甲磺隆半抗原与载体蛋白偶联制备免疫原：

称取8～18mg半抗原置于小棕瓶中，放入转子，加100～300uL N,N-二甲基甲酰胺中将其搅拌溶解，再加入6～13mg DCC和4～8mg NHS，磁力搅拌常温过夜，制备成A液；将15～25mg BSA置于25ml圆底烧瓶中，溶解于4～6mL 0.13mol/L的碳酸氢钠缓冲溶液中，制成B液；将A液缓慢滴加反应液B中，每1～2分钟滴加5～10uL，边滴加边搅拌，加完后，室温搅拌3h；反应后将上清液置于透析袋中，在4℃下用PBS透析3天，每8h换一次透析液；透析后，得到免疫原1，即Hapten-BSA；称取3～6mg半抗原置于小棕瓶中，放入转子，加100～300uL N,N-二甲基甲酰胺中将其搅拌溶解，再加入2.5～5mg DCC和1～3mg NHS，磁力搅拌常温过夜，制备成A液；将15～25mg KLH置于25mL圆底烧瓶中，溶解于4～6mL 0.13mol/L的碳酸氢钠缓冲溶液中，制成B液；将A液缓慢滴加反应液B中，每2分钟滴加5～10uL，边滴加边搅拌，加完后，室温搅拌3h；反应后将上清液置于透析袋中，在4℃下用PBS透析3天，每8h换一次透析液；透析后，得到免疫原2即，Hapten-KLH；称取11～25mg半抗原置于小棕瓶中，放入转子，加100～300uL N,N-二甲基甲酰胺中将其搅拌溶解，再加入18～37mg DCC和10～21mg NHS，磁力搅拌常温过夜，制备成A液；将15～25mg OVA置于25mL圆底烧瓶中，溶解于4～6mL0.13mol/L的碳酸氢钠缓冲溶液中，制成B液，将A液缓慢滴加反应液B中，每2分钟滴加5～10uL，边滴加边搅拌，加完后，室温搅拌3h，反应后将上清液置于透析袋中，在4℃下用PBS透析3天，每8h换一次透析液。透析后，得到免疫原3即，Hapten-OVA；

3)免疫动物，制得甲磺隆多克隆抗体。