[发明专利]一种水产品中有机镉的细胞毒性评价方法

说明书

本发明公开了一种水产品中有机镉细胞毒性的评价方法，首先通过有机镉对PC12细胞暴露，提取细胞内小分子代谢物，利用色谱质谱联用技术对细胞中心碳代谢相关的代谢物进行检测分析，通过与对照组细胞的代谢物进行比较，根据代谢物变化显著性差异评价有机镉对细胞产生的毒性作用机制，构建一种评估细胞受有机镉暴露后中心碳代谢通路变化的方法。本发明能有效的分析有机镉对细胞代谢途径的影响，具有简单，快速，获得信息全面等优点。

技术领域

本发明属于水产品重金属污染毒性评价领域，具体涉及一种水产品中有机镉的细胞毒性评价方法，是一种基于色谱质谱联用技术的评估方法，通过有机镉对细胞代谢路径的影响来评估不同赋形态镉对细胞毒性的作用机制以及毒性评价。

背景技术

因矿产资源的大量开发，工业的迅猛发展，大量镉元素已通过多种渠道进入水体，引起水生生物的重金属污染。环境中的镉含量很低，但许多水生生物对镉具有极强的富集能力，如鱼类可富集10³～10⁵倍，贝类可富集10⁵～10⁶倍，镉可沿食物链转移蓄积，最终危害人类身体健康。所以，镉已成为影响水产品食用安全的重要因素之一。

无机镉和有机镉(生物镉)是镉存在生物体内的两大形态。镉在环境中一般以无机离子态存在，但其进入生物体中，会与其诱导细胞产生的MT中的巯基络合形成更加稳定的有机态镉。目前对镉的毒性研究主要集中在生理生化、显微亚显微水平上，而对镉的毒性机制，特别是其毒性分子机制的研究还处于比较初级的阶段。

机体中各种代谢物相互作用，相互关联而使机体能够维持正常的生理活动，当机体受到外界刺激影响时会引起生物体内关键代谢过程中内源性物质的浓度，会造成机体代谢紊乱进而影响正常的生命活动。外界影响和刺激所引起机体的生理变化在代谢过程中会被反映和放大，代谢组学技术能够将成百上千种代谢物的变化通过谱图的方式展现出来，能很好地表征毒物毒性通路和作用机制，所以代谢组学技术在毒性作用机制研究上具有很大的优势。

当前的技术大多使用小鼠模型评测重金属毒性，实验过程繁琐，所用时间较长，效率低。该方法能有效的分析有机镉对细胞代谢途径的影响，具有简单，快速，获得信息全面等优点。

发明内容

本发明的目的是提供一种评估有机镉细胞毒性的方法。首先利用色谱质谱联用技术对细胞内小分子代谢产物进行有效的分析，利用生物学检测方法能对代谢物进行快速分析，评估有机镉的暴露对细胞代谢的影响。该方法能直观的分析有机镉对细胞代谢途径的影响，具有简单，快速，获得信息全面等优点。

本发明为实现上述目的所采用的技术方案是：以PC12细胞为模式细胞，以重金属镉以及镉-鲍鱼多糖复合物对PC12细胞进行暴露，分析了胞内中心碳代谢相关的极性小分子代谢产物变化，研究了不同赋性态镉暴露对细胞中心碳代谢产生的影响。

一种水产品中有机镉的细胞毒性评价方法，具体包括以下步骤：

S1、取大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞PC12(高分化)于培养板培养20～26h，待PC12(来自中国科学院细胞库)细胞铺满孔板被培养基覆盖面的80％～90％，用镉离子以及鲍鱼多糖-镉混合物对细胞进行暴露20～24h后收取细胞样品；

S2、取步骤S1所述细胞样品，提取细胞内小分子代谢物；

S3、利用LC-MS的质谱方法对所述小分子代谢物进行定量分析；色谱柱用亲水作用色谱柱，所述色谱柱包括：Waters,UPLC BEH Amide column(1.7μm,2.1×100mm)、HPLCLuna aminopropyl column(3.0μm,2.0×100mm)、SeQuant ZIC-HILIC column(3.5μm,2.1×100mm)、Xbridge Amide(3.5μm,4.6×100mm)中的一种。

优选方式下，所述水产品中有机镉的细胞毒性评价方法，包括步骤：