[发明专利]一种检测适配体与配体小分子结合过程中构象改变的方法

权利要求书

1.一种快速有效的检测适配体与配体小分子结合过程中构象改变的方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一：利用生物膜干涉技术对所选适配体与配体小分子之间的亲和力进行测定，确定两者可以结合后，再进行以下步骤的检测；所述的配体为茶碱，适配体为如SEQ ID NO.1所示的RNA序列；

步骤二：通过表面增强拉曼光谱技术，将适配体弱结合到SERS基底上，采集适配体在与配体小分子结合前后的谱图，根据SERS谱图前后的变化，确定适配体构象的改变，以及归属引起改变的原因；具体为：首先通过Lee法制备银胶溶液，并将得到的银胶溶液通过离心、去除上清液的办法浓缩，向浓缩后的银胶溶液中加入KI溶液，向溶液中加入MgSO₄溶液；将适配体弱结合到银胶表面之后，等比加入茶碱溶液；将混合好的适配体-茶碱溶液加入去离子水稀释，转移到96孔板中采集SERS信号；

步骤三：利用分子动力学模拟手段，模拟配体与适配体结合的动态过程，计算适配体与配体上主要基团的运动相关系数，解析结合过程中适配体的空间变化情况，并对引起构象变化的原因进行解释；所述的步骤三为：

（A）分子动力学模拟茶碱与适配体结合的动态过程

首先建立模拟体系的初始化；将茶碱、适配体体系置于适当大小水盒子中，复合物表面到水盒子边界距离为15Å，水模型选用SPC/E，然后对体系进行离子化处理；茶碱的力场参数文件由AmberTools生成；然后对体系进行能量最小化和平衡模拟；能量最小化使用最速下降算法，在不加约束条件下运行模拟500steps；平衡模拟分两步：第一步控制体系温度从0K升温至300K，在有约束条件下，运行模拟10000steps，第二步维持体系温度为300K，在有约束条件下，运行模拟10000steps；最后用平衡后的体系在NPT系综下模拟95ns，步长为2fs；控制压强在1.01atm，温度为310K；计算适配体-茶碱分子复合物体系随时间变化的RMSD值，来估计二者结合前后构象的变化程度；截取数个不同帧数的构象态，对构象变化过程进行分析；

（B）计算适配体与茶碱上主要基团的运动相关系数

采用gromacs获得每一帧的PDB文件；分别读取每一帧及后一帧质心坐标的PDB文件，采用每一个茶碱的后一帧质心坐标减去前一帧的质心坐标，获得每一帧质心坐标的移动向量；然后采用python中numpy.corrcoef()命令获得小分子质心坐标移动向量和每一个核苷酸质心坐标移动向量的皮尔逊积矩相关系数，记为运动相关系数；将所有相邻帧中每一个核苷酸与小分子的运动相关系数进行平均，获得平均运动相关系数；分别计算适配体上33个碱基与茶碱上N-1, N-3, N-7, N-9, C=O-2, C=O-6, CH3-1, CH3-3, 嘧啶环, 和咪唑环的运动相关系数，运动相关系数越接近1，表明两者的运动相关性越密切，即可能存在某种相互作用。

2.根据权利要求1所述的快速有效的检测适配体与配体小分子结合过程中构象改变的方法，其特征在于，所述的步骤一为：首先用缓冲液分别配制配体溶液和适配体溶液，然后将配制好的适配体溶液，配体溶液，缓冲液各200μL分别加入到各反应孔中后，连有链霉素的芯片按照既定程序依次浸入到各反应孔，一共要经历五个阶段，每个阶段耗时60s，包括：基线平衡，适配体耦合，传感器平衡，结合和解离，然后得到适配体-配体的亲和常数。

3.根据权利要求1所述的快速有效的检测适配体与配体小分子结合过程中构象改变的方法，其特征在于，所述的步骤二中的银胶溶液浓缩约60倍；所述的KI溶液浓度为1mM；所述的MgSO₄溶液浓度为10mM。

4.根据权利要求1所述的快速有效的检测适配体与配体小分子结合过程中构象改变的方法，其特征在于，所述的Lee法制备银胶溶液的方法为：将36mg 硝酸银粉末溶于200mL去离子水中，加热并不断搅拌至溶液微沸，然后加入4mL 1%的柠檬酸钠溶液，继续加热、搅拌约1h，溶液由无色变为灰绿色，停止加热，冷却至室温，避光保存。