[发明专利]一种帕利亚姆血清群病毒血清型的实时荧光定量RT-PCR检测引物、探针及检测试剂盒

说明书

本发明涉及一种帕利亚姆血清群病毒血清型的实时荧光定量RT‑PCR检测引物、探针及检测试剂盒，属于动物病毒分子生物检测技术领域。该试剂盒包括3对引物；还包括与三对引物对配合使用的三条探针、阴性对照模板、阳性对照模板、标准品模板和PCR扩增试剂。阴性对照模板为RNase‑free水；阳性对照模板分别为CHUV、BCV和DAV灭活病毒；标准品模板为CHUV、BCV和DAV基因节段2单链RNA。采用本发明试剂盒能够检出流行于中国的三种血清型PALV，具有特异、敏感、快速和高效等优势；并且配合利用标准品模板建立的标准曲线能够对临床样本内PALV各血清型毒株的RNA进行定量检测，大大提高了工作效率。

技术领域

本发明属于动物病毒分子生物学检测技术领域，具体涉及应用TaqMan实时荧光定量RT-PCR技术对中国流行的帕利亚姆血清群病毒的血清型进行快速检测的三对扩增引物、三条TaqMan探针及组装的检测试剂盒。

背景技术

帕利亚姆血清群病毒(Palyam serogroup virus,PALV)是呼肠孤病毒科(Reoviridae)环状病毒属(Orbivirus)成员，广泛流行于北纬49°至南纬35°之间的热带以及亚热带地区。PALV主要通过雌性吸血昆虫库蠓(Culicoides)对动物的吸血性叮咬传播，感染牛羊等反刍动物，导致妊娠动物的生产异常，主要表现为流产、早产、死产或产无脑畸形胎。1985年至1986年，帕利亚姆病毒疫情在曾在日本爆发，其临床症状为新生牛先天性异常，并伴有水脑畸形和小脑发育不良综合征，给畜牧业生产带来了巨大的经济损失。

PALV基因组由10个双链RNA节段(Seg1～Seg10)构成，共编码7个结构蛋白(VP1～VP7)和4个非结构蛋白(NS1～NS3和NS3A)。PALV具有双层衣壳结构，外层衣壳由Seg-2和Seg-6编码的VP2和VP5构成，主要参与介导宿主细胞表面吸附以及细胞膜通透等生物学过程。Seg-2和Seg-5都具有高度的遗传变异性，其中，由Seg-2编码的VP2是诱导被感染动物产生中和抗体的主要抗原，对PALV血清型具有决定性作用。PALV具有多种不同的血清型，由于历史原因，不同血清型的PALV往往以病毒首次分离地的地名进行命名，在亚洲存在ChuzanVirus(CHUV)、D’Aguilar Virus(DAV)和Bunyip Creek virus(BCV)三种血清型PALV的流行。

CHUV于2012年首次分离于我国云南省的哨兵牛，在随后开展的云南省、广东省和广西壮族自治区PALV监测与病毒分离工作中，除分离获得多株CHUV外，还在我国首次分离获得BCV和DAV，表明多种血清型的PALV流行于我国南方地区。我国内蒙古、新疆、山东、江苏、湖北、广西和云南等省区牛羊体内CHUV抗体的血清阳性率介于6％～48.65％之间，而海南省牛羊的血清阳性率高达57.35％；另外，甘肃省牦牛CHUV抗体的血清阳性率为7.89％。由此可见，PALV已在我国呈现广泛分布的趋势。由于不同血清型PALV之间交叉保护的效果不尽相同，而为了掌握PALV在我国的流行及分布情况，并制定科学的防控策略，所以，非常有必要建立能够快速鉴定PALV血清型的检测方法。

中和试验是血清型鉴定的“金标准”之一，能够对不同血清型的PALV进行检测，但是，进行中和试验不仅需要各血清型参考毒株和标准阳性血清，而且检测周期长达1～2周，费时费力。此外，中和试验需要使用参考毒株，存在病毒扩散等生物安全问题。因此，建立高效、快速和安全的鉴定PALV血清型检测方法和检测试剂盒不仅能够提高工作效率，而且能够为我国PALV的防控提供技术支持和知识储备。

荧光定量PCR技术是美国ABI公司于1996年推出的一种新型核酸定性及定量技术，该技术自发明以来，已经被广泛应用于细菌、病毒等病原体检测，具有特性强、灵敏度高、检测速度快、可进行高通量检测等优势，更为重要的是该技术可以用于临床样本检测，但是目前尚没有能够鉴定PALV血清型的一步法实时荧光定量RT-PCR(one step quantitativereal time RT-PCR,qRT-PCR)检测方法面世。

发明内容