[发明专利]一种蛋白在制备预防化脓隐秘杆菌感染的药物中的应用

说明书

本发明属于兽用生物制品领域，公布了化脓隐秘杆菌的一种抗原蛋白及其制备、疫苗应用、抗体检测方法。本发明将高度保守的化脓隐秘杆菌铁ABC转运体底物结合蛋白SBP的基因，克隆至pGEX‑4T‑1质粒，构建BL21（DE3）重组菌株，使用IPTG诱导表达重组蛋白SBP(GST‑SBP)，实现了目的蛋白的可溶性表达，采用Gluthathione‑Sepharose 4B层析法亲和纯化重组蛋白。本发明提供的重组SBP(GST‑SBP)蛋白具有良好的反应原性和免疫原性，能够与化脓隐秘杆菌免疫或感染的动物（小鼠、山羊）的血清反应，能够刺激动物（小鼠、羊）产生高水平特异抗体，小鼠免疫保护率为90%。本发明为制备预防化脓隐秘杆菌感染的药物提供了新的抗原蛋白。

技术领域

本发明属于兽用生物制品，具体涉及一种制备预防化脓隐秘杆菌感染的抗原蛋白。

背景技术

山羊产业近年来在三峡库区迅速发展，已成为助推农民脱贫致富和农村健康发展的重要产业之一。然而，疫病对地区养羊业的影响日益显现，其中危害较为严重的是化脓性肺炎，因其潜伏感染期长，临床症状不明显，化脓性病变导致肺脏组织不可逆损伤，严重影响羔羊存活率。化脓隐秘杆菌(Trueperella pyogenes)是山羊化脓性肺炎的重要病原之一(张素辉等，2015；付利芝等，2018；冯峰，2010.)。化脓隐秘杆菌是革兰氏阳性菌，主要寄生在动物上呼吸道、消化道、生殖道等黏膜，属于一种共生性条件致病菌，通常导致牛、羊、猪等多种动物的肺脏脓肿、肝脓肿、脑脓肿、乳腺炎、子宫内膜炎、流产和死胎等疾病(Rissetiet al，2017；Cohenetal，2018；Piersanti et al，2019)。

已鉴定的化脓隐秘杆菌毒力因子有溶血素(Pyolysin，PLO)和黏附蛋白胶原结合蛋白(collage-binding protein，CbpA)、神经氨酸酶(neuraminidases，Nan)NanH和NanP等，PLO是其主要的保护性抗原，至今没有新保护性抗原的发现。

铁是病原菌抵御宿主杀菌作用、维持生存和毒力的必需微量元素，致病菌需要利用自身表达的ABC(ATP binding cassette，ABC)转运体等系统从宿主体内摄取铁(Casabona et al，2017；2017；Peng et al，2018)。ABC转运体是膜相关蛋白或表面蛋白，负责细胞内外物质的跨膜运输，由ABC型膜透酶(permease)、ATP结合蛋白质(或称ATP酶，ATPase)和底物结合蛋白(substrate-binding protein，SBP)组成，SBP决定ABC转运体的特异性。SBP是一个保守的细菌黏附蛋白家族，同时也是毒力决定因子，在细菌致病性和体内生存中发挥重要作用。

山羊化脓隐秘杆菌重庆分离株基因组编码有铁ABC转运体等细菌铁摄取相关ABC转运体(张素辉等，2016)。这些蛋白与已公布基因组的其他化脓隐秘杆菌菌株的铁摄取ABC转运体等蛋白高度保守，它们在宿主体内不同铁环境条件下会出现差异表达，以适应宿主体内不同组织的铁源。

通过免疫印迹和质谱分析课题组发现，与化脓隐秘杆菌免疫的小鼠血清发生抗原抗体反应的化脓隐秘杆菌菌体蛋白可能是铁ABC转运体组分SBP。免疫印迹显示，重组SBP(GST-SBP融合蛋白)可被化脓隐秘杆菌免疫的小鼠血清识别，出现出现特异条带。进一步地，被重组SBP免疫的小鼠可获得抗化脓隐秘杆菌感染的能力，免疫保护率不低于90％。

发明内容

本发明的目的是提供一种化脓隐秘杆菌铁ABC转运体底物结合蛋白SBP，并将该重组蛋白与佐剂联合免疫动物，检测抗原免疫动物的血清抗体水平及保护率，免疫小鼠产生了较高水平的特异性抗体，保护率为90％；可诱导羊只产生高水平特异性抗体。所述蛋白可用于制备预防化脓隐秘杆菌致死性感染的药物。

本发明的目的是通过以下措施实现的：

一种蛋白，氨基酸序列为SEQ ID NO.2。