[发明专利]基于酶联免疫斑点试验试剂盒计算ESAT-6抗原孔平均斑点面积的方法

说明书

本发明公开了一种基于酶联免疫斑点试验试剂盒计算ESAT‑6抗原孔平均斑点面积的方法，该方法首先将收集待测的外周血单个核细胞悬液加入包被有IFN‑γ抗体的微孔培养板内；并向待测的外周血单个核细胞悬液中加入ESAT‑6蛋白液培养，再向对应的微孔内加入IFN‑γ抗体酶标工作液孵育；每孔加入底物室温避光孵育、干燥；使用斑点计数仪计算微孔板内斑点形成细胞的平均斑点面积；本发明的方法通过ELISPOT技术检测结核特异性抗原ESAT‑6刺激条件下外周血单个核细胞释放IFN‑γ并通过显色形成的斑点的平均斑点面积，从而指导医生对活动性结核患者和潜伏性结核患者进行鉴别诊断。

技术领域

本发明涉及活动性结核病的领域，具体涉及一种基于酶联免疫斑点试验试剂盒计算ESAT-6抗原孔平均斑点面积的方法。

背景技术

结核是威胁人类健康的重大疾病之一，主要引起肺部疾病，其发病率和死亡率均居高不下。历史上，结核病曾在世界上广泛流行，数亿人被夺走生命。20世纪50年代以来，抗结核药物不断被发现，使结核病的流行得到了一定的控制。近年来，由于有些国家对结核病防治工作的忽视，加上流动人口增加、艾滋病感染者的传播以及耐药结核菌株不断出现等因素，使结核病流行有所回升。结核病仍是全球前10位死因之一，世界卫生组织2017年估算全球结核病新发患者约1000万，死亡数约为157万。全球结核病潜伏感染人群约为17亿，潜伏感染率为23％。因此，世界卫生组织已宣布进入“全球结核病紧急状态”，并将每年的3月24日定为“世界防治结核病日”，同时制定了2030年终止结核病的计划。

面对如此严峻的形势，我们应该及早采取措施。结核病的早期诊断及有效治疗是结核病防治工作的重中之重，对于控制结核分枝杆菌传播有着重要的临床意义。目前国内大多数医院根据直接涂片镜检，结核分枝杆菌培养技术，以及分子学检测手段如Gene-Xpert MTB/RIF对活动性结核进行诊断。结核菌涂片检查虽然简单易行且准确性高，但阳性率低。结核分枝杆菌培养检测结果可信度高，但耗时较长，不能满足临床需求。Gene-Xpert检测虽然特异性高，耗时短，但是在少菌样本中检测敏感性依然不能满足要求。此外，结核菌素皮试(PPD)实验是目前国内诊断结核菌感染的主要依据。此法简单易行且费用低，但是其最大缺点在于PPD试验所用抗原为结核分枝杆菌粗提的抗原混合物，和许多非结核分枝杆菌及卡介苗(BCG)均存在共同抗原成分，从而导致该法用于结核病诊断特异性差。中国是结核病高度流行区，由于广泛接种BCG，也造成PPD实验假阳性率很高，所以临床上只能根据PPD实验皮肤的反应强弱给予辅助诊断。

细胞免疫介导的结核分支杆菌γ-干扰素(IFN-γ)释放试验是近年来采用酶联免疫吸附法(ELISA)或酶联免疫斑点法(ELISPOT)，通过定量检测受检者外周血单个核细胞在结核分枝杆菌特异抗原刺激下释放的IFN-γ，从而对潜伏和活动性结核感染进行诊断。该方法原理为Th1型分泌因子IFN-γ与体内结核菌抗原含量密切相关。被结核分枝杆菌抗原致敏的T细胞再次遇到同类抗原时能产生高水平的IFN-γ，因此被用于结核感染的诊断。根据此原理，英国牛津免疫技术公司已研发出TSPOT-TB结核感染诊断试剂盒，该试剂盒应用结核菌特异性抗原早期抗原靶6(ESAT-6)、培养滤液蛋白10(CFP-10)刺激受检者外周血中单个核细胞，通过检测IFN-γ水平从而对结核感染进行诊断。该实验不受BCG及非结核分枝杆菌影响，且其检测灵敏度和特异性均高。遗憾的是，基于γ-干扰素释放试验的方法虽然能对结核分枝杆菌感染进行快速诊断，但该方法却不能用于区分活动性与潜伏性结核感染。

活动性结核患者应尽早给予治疗。然而，中国是结核病大国，存在大量的潜伏性结核感染者，这类潜伏性结核感染人群可能终生都没有临床症状，也不需要进行任何治疗。由于γ-干扰素释放试验的高灵敏性，除了活动性结核感染者之外，应用此方法检测潜伏性结核感染者也均为阳性，因此给临床用药带来困难。此也为γ-干扰素释放试验进行结核诊断在中国难以推广的重要原因。如果能开发出能区分活动与潜伏性结核感染的检测方法，将对我国结核病诊断及治疗具有重要意义。