[发明专利]一种利用沙雷氏菌提纯碱性金属蛋白酶的工艺方法在审
| 申请号： | 201910981802.8 | 申请日： | 2019-10-16 |
| 公开（公告）号： | CN110607294A | 公开（公告）日： | 2019-12-24 |
| 发明（设计）人： | 张国基;张希兰;汤燕雯;赵甜 | 申请（专利权）人： | 佛山市金净创环保技术有限公司 |
| 主分类号： | C12N9/52 | 分类号： | C12N9/52 |
| 代理公司： | 44463 佛山粤进知识产权代理事务所(普通合伙) | 代理人： | 张敏 |
| 地址： | 528000 广东省佛山市南海区桂城街道*** | 国省代码： | 广东;44 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 沙雷氏菌 超滤管 蛋白酶 碱性金属 梯度洗脱 粗酶液 缓冲液 上样 脱盐 植物病毒病防治药剂 抗病毒活性物质 浓缩 蛋白质类物质 抗病毒活性 抗病毒效果 硫酸铵沉淀 发酵培养 分泌蛋白 去离子水 性质稳定 平衡液 色谱柱 洗脱峰 洗脱液 提纯 溶胀 透析 脱气 无菌 冲洗 预制 清洗 溶解 蛋白 筛选 研究 | ||
1.一种利用沙雷氏菌提纯碱性金属蛋白酶的工艺方法，其特征在于，包括以下步骤：
用无菌的去离子水分别将Q Sephacryl Fast Flow和Sephacryl S100HR溶胀、脱气；
在预制Q Sephacryl Fast Flow色谱柱上样，用pH 4.0-9.0、20mmol/L的Tris-HCl平衡液冲洗，用不同浓度的NaCl进行梯度洗脱，用超滤管，pH 7.2、10mmol/L的PBS缓冲液进行脱盐，用不同浓度的NaCl进行梯度洗脱，用超滤管脱盐、浓缩；
将黏质沙雷氏菌发酵培养，获得粗酶液；
用硫酸铵沉淀粗酶液后，用pH 7.2、10mmol/L PBS缓冲液溶解、透析；
上样至Sephacryl S100HR柱，用pH 7.2、10mmol/L的PBS洗脱液清洗，收集洗脱峰，用超滤管浓缩，即得到碱性金属蛋白酶。
2.根据权利要求1所述的利用沙雷氏菌提纯碱性金属蛋白酶的工艺方法，其特征在于，所述Tris-HCl平衡液的pH 5.0。
3.根据权利要求1所述的利用沙雷氏菌提纯碱性金属蛋白酶的工艺方法，其特征在于，所述NaCl洗脱液的浓度为0.2mol/L。
4.根据权利要求1所述的利用沙雷氏菌提纯碱性金属蛋白酶的工艺方法，其特征在于，所述超滤管的最大截留分子量3000Da。
5.根据权利要求1所述的利用沙雷氏菌提纯碱性金属蛋白酶的工艺方法，其特征在于，所述粗酶液的制备方法，步骤为：
黏质沙雷氏菌菌液在28℃恒温、120rpm摇床中振荡培养72h取出后6000×g离心10min，收集上清液，即为粗酶液。
6.根据权利要求5所述的利用沙雷氏菌提纯碱性金属蛋白酶的工艺方法，其特征在于，所述黏质沙雷氏菌菌液的制备方法，步骤为：
取黏质沙雷氏菌单菌落放至LB液体培养基中，28℃、120rpm震荡培养16h。
7.根据权利要求1所述的利用沙雷氏菌提纯碱性金属蛋白酶的工艺方法，其特征在于，所述硫酸铵沉淀粗酶液包括以下步骤：
(1)向粗酶液中缓慢加入硫酸铵并缓慢搅拌，至硫酸铵终浓度达到45％后，静置16h；
(2)然后用高速冷冻离心30min弃沉淀，收集上清；
(3)向上清液中缓慢加入硫酸铵至终浓度达到85％，然后静置16h；
(4)再次高速冷冻离心30min弃上清，收集沉淀。
8.根据权利要求7所述的利用沙雷氏菌提纯碱性金属蛋白酶的工艺方法，其特征在于，所述步骤(1)中在冰上操作加入硫酸铵。
9.根据权利要求7所述的利用沙雷氏菌提纯碱性金属蛋白酶的工艺方法，其特征在于，所述硫酸铵沉淀粗酶液在4℃条件下操作。
10.根据权利要求7所述的利用沙雷氏菌提纯碱性金属蛋白酶的工艺方法，其特征在于，所述高速冷冻离心的条件为4℃、11000×g。
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