[发明专利]一种酶催化制备赖氨酸寡肽及其单甲氧基聚乙二醇修饰的方法

说明书

本发明涉及一种酶催化制备赖氨酸寡肽及其单甲氧基聚乙二醇修饰的方法，属于酶催化反应技术领域。其采用蛋白酶为催化剂催化合成酪氨酸寡肽，然后在寡聚酪氨酸寡肽的氨基末端接枝单甲氧基聚乙二醇，制备得到单甲氧基聚乙二醇修饰赖氨酸寡肽。本发明方法涉及的聚肽合成步骤的催化剂为酶多相催化剂，具有反应条件温和、环境更友好、副反应少等优点，而且避免了繁琐的保护和去保护步骤，提供了一种应用前景良好的制备单甲氧基聚乙二醇修饰赖氨酸寡肽的方法，其制备所得的赖氨酸寡肽条件温和、无污染，产率最高达35%。

技术领域

本发明涉及一种酶催化制备赖氨酸寡肽及其单甲氧基聚乙二醇修饰的方法，属于酶催化反应技术领域。

背景技术

人工聚肽是以天然氨基酸为单体进行聚合反应，通过酰胺键而形成的聚氨基化合物，性质与天然肽、聚氨基酸和蛋白质类似。由人工聚肽形成的材料具有良好的生物亲和性和可降解性。聚肽或其改性低聚物表现出自组装、液晶行为等独特结构性质，具有较强可塑性，在生物、医药和天然高分子材料领域具有很大的应用潜力。

赖氨酸聚肽的研究在国外特别是在日本已比较成熟，我国刚刚起步。它是一种天然的生物代谢产品。具有很好的杀菌能力和热稳定性，是具有优良防腐性能和巨大商业潜力的生物防腐剂。在日本，赖氨酸聚肽已被批准作为防腐剂添加于食品中，广泛用于方便米饭、湿熟面条、熟菜、海产品、酱类、酱油、鱼片和饼干的保鲜防腐中。同时还发现赖氨酸聚肽和其他天然抑菌剂配合使用，有明显的协同增效作用，可以提高其抑菌能力。

氨基酸聚合法有固相法、NCA法和酶催化法。与其它聚合方法相比，酶催化法具有反应条件温和、环境更友好、副反应少等优点，而且避免了繁琐的保护和去保护步骤。本发明拟采用蛋白酶为催化剂催化合成赖氨酸寡肽，并对赖氨酸寡肽进行单甲氧基聚乙二醇修饰，提高其亲水性。

发明内容

本发明的目的是克服上述不足之处，提供一种反应条件温和、环境更友好的酶催化制备赖氨酸寡肽及其甲氧基聚乙二醇修饰的方法。

本发明的技术方案，酶催化制备赖氨酸寡肽及其单甲氧基聚乙二醇修饰的方法具体包括（1）蛋白酶多相催化剂的制备；（2）赖氨酸寡肽的合成；（3）甲氧基聚乙二醇的修饰制备赖氨酸寡肽-单甲氧基聚乙二醇共聚物。

（1）蛋白酶多相催化剂的制备：将蛋白酶用磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液配置成蛋白质溶液，在其中加入乙二醇二缩水甘油醚室温下搅拌反应，反应结束后离心收集沉淀，冷冻干燥，即制得蛋白酶多相催化剂。

具体步骤如下：将蛋白酶用磷酸缓冲液配置成质量百分比为5~20%的蛋白质溶液。在蛋白质溶液中加入乙二醇二缩水甘油醚后在室温下搅拌反应4～8小时。缓冲溶液中蛋白质与乙二醇二缩水甘油醚的质量比为1:20～1:50。反应结束后将反应液在300~5000rpm离心5~10分钟，收集沉淀冷冻干燥，即为蛋白酶多相催化剂。

所述蛋白酶为菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶中的任一种。

所述磷酸缓冲液为0.1~0.2M的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，磷酸缓冲液的pH值为7.0~8.5。

（2）酶催化合成合成赖氨酸寡肽：在磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液中加入L-赖氨酸甲酯盐酸盐，叔丁醇和蛋白酶多相催化剂，混合反应后离心，去上清液采用冰乙醇醇提，离心取沉淀冷冻干燥后制得赖氨酸寡肽。

具体步骤如下：在5.0～10.0mL、pH值为5.5~8.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液中加入2～6g的L-赖氨酸甲酯盐酸盐和10～20U蛋白酶多相催化剂，再加入缓冲液体积分数30%～45%的叔丁醇，充分混合，置于恒温振荡器中以300~600rpm的转速在20～50℃下反应6～12小时；反应结束后，将反应混合物在在8000~10000rpm下离心2～4分钟，取上清液加入100mL预先冷却至0℃冰乙醇，在8000~10000rpm下离心2～4分钟，沉淀冷冻干燥后得到赖氨酸寡肽。