[发明专利]一种基于香樟叶片的端粒长度测定树龄的方法

说明书

本发明通过提取香樟叶片的基因组DNA，用Taq I(5'‑TCGA‑3')限制性内切酶进行酶切，以5'‑TTTAGGG‑3'寡核苷酸作为单链DNA探针，进行核酸杂交，测定杂交产物的末端限制性片段长度(TRF)，表示叶片的端粒长度，建立预测香樟树龄的相关性曲线模型，进而对香樟的树龄进行预测。结果表明，利用本发明的相关性曲线模型预测的香樟树龄与实际树龄比较一致，说明该曲线模型准确性较高，可以有效且准确地测定香樟树龄。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地，涉及一种基于香樟叶片的端粒长度测定树龄的方法。

背景技术

香樟(Cinnamomum camphora(L.)Presl)为樟科、樟属的常绿大乔木，是我国长江流域及其以南重要的珍贵乡土树种。江西是香樟重要分布区，古香樟(古樟)遍布全省各地，甚至千年以上的古樟成为多地的重要景观，更是研究香樟乃至当地自然地理变迁的宝贵种质资源。香樟树龄的准确测定是保护和保存樟树重要遗传资源的基础。

近年来，随着分子生物学的发展，通过分子手段来检测植物的年限得到了一定程度的发展。端粒(telomere)是位于真核细胞线性染色体DNA末端，由DNA重复序列与蛋白质组成的特异复合体结构。端粒序列第一次是在拟南芥中克隆成功的。研究发现，端粒长度的变化可以表征植物年龄。一般认为，随着植物生理年龄的增加，端粒长度逐步缩短，直至缩短到极限，细胞分裂停止，进入衰老状态。端粒长度可以反映细胞的生理年龄和细胞复制能力，在一定程度上反映了植物无性繁殖能力。端粒长度在不同树种、树龄、组织、生理年龄、同一植物不同的生长发育时期、不同环境下的相同部位都会存在差异。

由于香樟树龄极长，还不知道樟树的树龄到底能达到多少年，这种情况下端粒长度能否表征香樟树龄，如果表征香樟树龄，能否用端粒长度推断香樟的寿命，是需要解决的问题。

发明内容

为了准确地测定香樟树龄，本发明提出了一种基于叶片端粒长度(TRF值)测定香樟树龄的方法。

本发明提供了一种测定香樟树龄的方法，其中，所述方法包括如下步骤：

(1)提取香樟叶片的基因组DNA；

(2)用Taq I限制性内切酶对提取的所述基因组DNA进行酶切，得到酶切产物；

(3)以5'-TTTAGGG-3'所示的寡核苷酸作为单链DNA探针，对所述酶切产物进行核酸杂交，得到杂交产物；

(4)对所述杂交产物的末端限制性片段长度(TRF)进行测定，表示所述香樟叶片的端粒长度；

(5)通过式I所示的香樟树龄与端粒长度的相关性曲线模型来计算香樟树龄，以所述端粒长度作为y值，通过式Ⅰ来计算x值，即为所述香樟的树龄：

y＝6E-05x²-0.065x+27.78 式Ⅰ，

其中，式Ⅰ中的x代表香樟的树龄，y代表端粒长度。

在上述方法中，所述香樟叶片为香樟当年生叶片。

在上述方法中，用于酶切的所述基因组DNA的重量为15μg。

在上述方法中，用于酶切的所述基因组DNA的浓度大于50ng/μL。

在上述方法中，所述基因组DNA的提取方法为改良CTAB法。

在上述方法中，所述探针带有非放射性荧光标记。

在上述方法中，所述荧光标记是地高辛。