[发明专利]一株产丁二酸的大肠杆菌基因工程菌及其构建方法与应用

说明书

本发明公开了一种产丁二酸的大肠杆菌基因工程菌，该大肠杆菌中过表达电子转换通道蛋白和细胞色素c成熟系统I蛋白，所述电子转换通道的蛋白基因序列如SEQ ID NO:1所示，所述细胞色素c成熟系统I蛋白的基因序列如SEQ ID NO:2所示。本发明在大肠杆菌中构建适配性高的跨膜电子通道，使其可以引入外源电子，调节细胞内NAD+/NADH，为微生物细胞内氧化还原调控提供了新的解决方案。通过异源表达Mtr途径的基因的构建重组大肠杆菌，使得重组大肠杆菌获得传递电子的能力，丁二酸产量提高了33.5％。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一株产丁二酸的大肠杆菌基因工程菌及其构建方法与应用。

背景技术

以可再生资源替代不可再生的化石资源，是转变经济增长模式、保障社会经济可持续发展的重大战略需求。可再生资源，如风能、太阳能、生物质能等，目前最有效的利用方式是转变为电能。因此，电能在未来工业制造中将扮演着重要角色。在化学品制造领域，利用化学催化剂电合成化学品已经得到广泛应用；相对于化学催化剂，生物催化剂具有可再生、高转化活性、底物多样性等优点，近年来在电合成领域的应用受到日益广泛关注。

微生物电合成是近年来在微生物燃料电池基础上发展起来的新技术。微生物燃料电池一般将产电作为目的，而微生物电合成以利用电能生产化学品为目的。目前微生物电合成技术主要用于厌氧还原性代谢产物的合成，其原理是将电极的阴极提供电子转换为胞内可利用的还原力NADH，调节胞内NAD+/NADH，从而提高还原性目标产物的合成。目前微生物电合成技术在丁醇、丁酸、丁二酸等厌氧还原性代谢产物的合成过程取得了一定的进展。

在微生物体内，电子从电子供体(低电势)传递至电子受体(高电势)，这是微生物新陈代谢的固有特征。NAD+是细胞内电子主要载体之一，NAD+/NADH作为生物氧化还原的辅因子，对生物代谢终产物的分布有着重要的影响，尤其在厌氧代谢过程中。例如在E.coli厌氧合成丁二酸的代谢过程中，1分子葡萄糖合成2分子中间产物PEP过程中产生2分子NADH，然而2分子PEP合成2分子丁二酸需要4分子NADH。因此，还原力不足是厌氧合成丁二酸的主要限制性因素。通过基因工程手段强化电子载体再生途径、增加电子载体的总量以及胞外氧化还原电位调控等方法有效地控制了细胞内电子流向，调节了细胞内NAD+/NADH，减少了副产物合成，提高了丁二酸的产量。本文旨在利用微生物电合成技术，在大肠杆菌内构建适配性高的跨膜电子通道使其可以引入外源电子，为微生物细胞内氧化还原调控提供了新的解决方案。

发明内容

发明目的：提供一株过表达电子转换通道蛋白和细胞色素c成熟系统I蛋白的大肠杆菌基因工程菌，以在大肠杆菌中构建适配性高的跨膜电子通道，使其可以引入外源电子，调节细胞内NAD+/NADH，为微生物细胞内氧化还原调控提供了新的解决方案。

本发明进一步提供上述过表达电子转换通道蛋白和细胞色素c成熟系统I蛋白的大肠杆菌基因工程菌的构建方法及其在制备丁二酸中的应用。

技术方案：为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

一株大肠杆菌基因工程菌，该大肠杆菌中过表达电子转换通道蛋白和细胞色素c成熟系统I系统蛋白。

作为优选，所述电子转换通道的蛋白基因序列如SEQ ID NO:1所示，所述细胞色素c成熟系统I蛋白的基因序列如SEQ ID NO:2所示。

mtrCBA基因表达S.oneidensis MR-1的细胞色素c蛋白MtrC、MtrB、MtrA蛋白，其是构成S.oneidensis MR-1直接电子传递途径Mtr途径的必要蛋白，MtrC、MtrB、MtrA通常共同以MtrCAB复合物的形式行使电子转移功能。

ccmABCDEFGH是细胞色素c成熟基因簇，首先脱辅基的细胞色素c其内部血红素结合位点CXXCH中的半胱氨酸侧链巯基与辅基血红素共价连接，形成成熟的细胞色素c，这一过程需要八个完整的膜蛋白(ccmABCDEFGH)完成。