[发明专利]一种大规模培养CHO细胞以制备乙型肝炎疫苗的方法

说明书

本发明公开了一种大规模培养CHO细胞以制备乙型肝炎疫苗的方法。该方法包括细胞重组、细胞增殖、灌流培养、对收获的培养液进行浓缩富集、纯化、纯化液加入甲醛处理、半成品配制以及半成品经分装后获得成品。其中灌流培养具体是：当细胞密度增殖到2×10⁶cells/ml以上时，更换维持液进行灌流培养，灌流培养时，不断补充新的维持液，同时收集细胞培养液。本发明采用生物反应器高密度培养，培养后的细胞密度可以达到3×10⁷cells/ml，活率大于98％，收获液对应的HBsAg抗原产量可达到13mg/L以上，比现行转瓶工艺提高50％以上，从而提高重组乙型肝炎疫苗的生产效率，克服现有技术中生产效率低的缺陷。

技术领域

本发明涉及了疫苗制作领域，具体的是一种大规模培养CHO细胞以制备乙型肝炎疫苗的方法。

背景技术

现有乙肝疫苗有酵母乙肝疫苗和CHO细胞乙肝疫苗两种。两种疫苗都是利用现代生物技术进行的基因重组生物制品。

酵母重组乙肝疫苗是一种包含有HBsAg亚单位疫苗，是利用现代生物学技术将HBsAg基因克隆至酵母中，通过培养重组酵母来表达乙肝表面抗原。酵母系统虽然有表达量高成本低的优势，但是存在表达系统产生的HBsAg无糖基化的缺点，同时不能外分泌，产物的分离纯化比较困难。

CHO细胞乙肝疫苗是将HBsAg基因克隆至CHO细胞中，通过培养重组CHO细胞来表达乙肝表面抗原。其表达产生的HBsAg更接近天然的HBsAg，产物的分离纯化也比较简单。但哺乳动物细胞对培养条件的要求都很高，现有的生产工艺是利用转瓶进行的培养工艺，存在效率低、成本高、容易污染的风险。

发明内容

为了克服现有技术中的缺陷，本发明实施例提供了一种大规模培养CHO细胞以制备乙型肝炎疫苗的方法，所述方法包括以下步骤,

S1.细胞重组：提供带有HBsAg抗原序列的重组CHO细胞，并在培养环境温度为35℃～38℃的情况下对所述重组CHO细胞进行传代递增，培养时间为2天-6天；

S2.细胞增殖：将所述重组CHO细胞按1×10⁵～1×10⁶cells/ml的浓度转入生物反应器继续进行培养，重组CHO细胞生物反应器继续增殖，培养条件为温度35℃～38℃，溶氧量30％～90％，pH值6.8～7.4；

S3.灌流培养：当细胞密度增殖到2×10⁶cells/ml以上时，更换维持液进行灌流培养，灌流培养时，不断补充新的维持液，同时收集细胞培养液；灌流培养的培养条件为温度30℃～38℃，溶氧量30％～90％，pH值7.0～7.6。

S4.培养液浓缩：对收获的培养液进行浓缩富集，获得收获液；

S5.收获液纯化：对收获液进行纯化，获得纯化液；

S6.纯化液加入甲醛处理：将甲醛加入至纯化液中并充分混合，保持温度为2℃～37℃，处理时间为72-120小时，再经超滤、浓缩、除菌过滤获得HBsAg抗原液获得HBsAg抗原液；

S7.半成品制作：首先将HBsAg抗原液经适当稀释，然后加入氢氧化铝获得半成品；

S8.半成品经分装后，获得成品，每次人用剂量为0.5ml或1.0ml，含HBsAg10μg或20μg。

进一步地，所述维持液为含2％～8％牛血清适宜细胞贴壁生长的培养基。

进一步地，所述维持液为不含血清适宜细胞悬浮生长的培养基。

进一步地，所述收获液纯化的方法为蛋白沉淀、浓缩、超速离心、离子交换、疏水和凝胶色谱中的一种或多种组合。

进一步地，所述培养液浓缩方法为超滤。