[发明专利]一种羊毛硫肽前体肽amyA2及其制备方法和应用

说明书

本发明公开了一种羊毛硫肽前体肽amyA2及其制备方法和应用，涉及生物技术领域。羊毛硫肽前体肽amyA2的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。在解淀粉芽孢杆菌发酵过程中添加本发明羊毛硫肽前体肽amyA2，可以显著提高解淀粉芽孢杆菌代谢产物抗菌活性，抗菌活性持续时间是原来的3倍以上。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种羊毛硫肽前体肽amyA2及其制备方法和在提高解淀粉芽孢杆菌代谢产物抗菌活性过程中的应用。

背景技术

现代农业生产过程中，最大的难题就是植物病害影响作物产量。目前植物病害根据病原传播方式可分为：土传病害、气传病害、种传病害和介体传播病害等。其中土传病害与气传病害最为常见。土传病害是指病原体如真菌、细菌、线虫和病毒随病残体生活在土壤中，条件适宜时从作物根部或茎部侵害作物而引起的病害。侵染病原包括真菌、细菌、放线菌等，其中真菌为主。在温室中发生最为普遍、危害最为严重的是早疫病病菌。气传病害是指病菌或孢子随气流传播，一般距离比较远。在发病期，空气带有大量的病菌，一旦条件适宜即可侵染发病。例如灰霉病，是由灰葡萄孢菌侵染所致，属真菌病害，花、果、叶、茎均可发病。该种病害是一种气传性病害，可随空气、水流及农事作业进行传播。

目前针对农业病害的防治多采用播撒化学农药的传统方法。该种方法不仅会对环境造成污染，还会危害其他动植物以及人类的健康。近年来，科研人员开始采用生物防治的方法治理植物病害，生物农药具有高效、环保、不产生抗药性等一系列优点。因此，寻求新型高效生物防治手段来解决植物病害已刻不容缓。目前关于生防菌株的研究主要包括生防细菌(芽孢杆菌、土壤放射杆菌、假单胞杆菌)和生防真菌(木霉菌)。其中芽孢杆菌属的解淀粉芽孢杆菌对于多种植物病害具较好的抑制作用。尽管解淀粉芽孢杆菌代谢产物具有较高的经济价值，但是在工业化生产方面存在收率低、提取工艺繁琐等问题。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种羊毛硫肽前体肽amyA2及其制备方法和应用，在解淀粉芽孢杆菌发酵过程中添加本发明羊毛硫肽前体肽amyA2，能够显著提高解淀粉芽孢杆菌代谢产物抑菌活性，抑菌活性持续时间是原来的3倍以上。

为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：一种羊毛硫肽前体肽amyA2，该羊毛硫肽前体肽amyA2的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

上所羊毛硫肽前体肽amyA2的制备方法为：羊毛硫肽前体肽amyA2由具有特定基因序列的羊毛硫肽前体肽amyA2基因通过大肠杆菌异源表达或人工合成获得。

上述羊毛硫肽前体肽amyA2基因来源于解淀粉芽胞杆菌WS-8。提取解淀粉芽胞杆菌WS-8的基因组为模板，以引物A2-S、A2-A为上下游引物(SEQ ID NO:3；SEQ ID NO:4)，PCR扩增获得羊毛硫肽前体肽amyA2基因片段。

上述羊毛硫肽前体肽amyA2，该前体肽amyA2的基因序列如SEQ ID NO:2所示。

大肠杆菌异源表达方法：

(1)羊毛硫肽前体肽amyA2重组载体构建及转化：将羊毛硫肽前体肽amyA2基因片段通过基因重组的方法构建到PET-28a载体上。利用热激转化的方法将重组载体转入大肠杆菌BL21(DE3)中。

(2)羊毛硫肽前体肽amyA2诱导表达：在液体LB培养基中培养BL21表达菌种，通过添加IPTG诱导羊毛硫肽前体肽amyA2蛋白的异源表达，用8M尿素溶液重悬菌体后，超声破碎菌体，释放羊毛硫肽前体肽amyA2。离心收集上清，使用孔径为1000Da大小的透析袋，透析三天，最后冷冻干燥至粉末状羊毛硫肽前体肽amyA2。

上述羊毛硫肽前体肽amyA2的应用为：羊毛硫肽前体肽amyA2在提高解淀粉芽孢杆菌代谢产物抗菌活性过程中的应用。

优选地，羊毛硫肽前体肽amyA2的添加时期为：解淀粉芽孢杆菌发酵起始至对数生长期末期。