[发明专利]一种羊毛硫肽前体肽amyA6及其制备方法和应用

说明书

本发明公开了一种羊毛硫肽前体肽amyA6及其制备方法和应用，涉及生物技术领域。羊毛硫肽前体肽amyA6的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。在解淀粉芽孢杆菌发酵过程中添加本发明羊毛硫肽前体肽amyA6，可以显著提高解淀粉芽孢杆菌代谢产物抗菌活性，抗菌活性持续时间是原来的4倍以上。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种羊毛硫肽前体肽amyA6及其制备方法和在提高解淀粉芽孢杆菌代谢产物抗菌活性过程中的应用。

背景技术

在如今农业生产过程中，植物病害是影响作物产量的一个主要原因。解决农业病害的问题，目前多采用播撒化学农药的传统方法。该种方法不仅会对环境造成污染，还会危害其他动植物以及人类的健康。近年来，科研人员开始采用生物防治的方法治理植物病害，生物农药具有高效、环保、不产生抗药性等一系列优点。因此，寻求新型高效生物防治手段来解决植物病害已刻不容缓。

目前关于生防菌株的研究主要包括生防细菌(芽孢杆菌、土壤放射杆菌、假单胞杆菌)和生防真菌(木霉菌)。其中芽孢杆菌属的解淀粉芽孢杆菌对于多种植物病害具较好的抑制作用，并具有广谱的抗菌活性。大量研究表明来源于解淀粉芽孢杆菌抗菌物质对于镰刀干腐病、早疫病、灰霉病、等植物病害都有良好的防治作用。

如今无论是在防治植物病害还是医学临床治疗过程中，病菌的耐药性都是一大难题。芽孢杆菌能够产生多种代谢产物，羊毛硫肽作为一种抗菌肽与传统抗生素相比具有双重作用机制，能够对多种细菌、真菌(多重耐药菌)有抑制作用并且不易产生耐药性，有望应用于农业生产以及临床医学等方面。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种羊毛硫肽前体肽amyA6及其制备方法和应用，在解淀粉芽孢杆菌发酵过程中添加本发明羊毛硫肽前体肽amyA6，可以显著提高解淀粉芽孢杆菌代谢产物抗菌活性，抗菌活性持续时间是原来的4倍以上。

为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：一种羊毛硫肽前体肽amyA6，该羊毛硫肽前体肽amyA6的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

上所羊毛硫肽前体肽amyA6的制备方法为：羊毛硫肽前体肽amyA6由具有特定基因序列的羊毛硫肽前体肽amyA6基因通过大肠杆菌异源表达或人工合成获得。

上述羊毛硫肽前体肽amyA6基因来源于解淀粉芽胞杆菌S499。提取解淀粉芽胞杆菌S499的基因组为模板，以引物A6-S、A6-A为上下游引物(SEQ ID NO:3；SEQ ID NO:4)，PCR扩增获得羊毛硫肽前体肽amyA6基因片段。

上述羊毛硫肽前体肽amyA6，该前体肽amyA6的基因序列如SEQ ID NO:2所示。

大肠杆菌异源表达方法：

(1)羊毛硫肽前体肽amyA6重组载体构建及转化：将羊毛硫肽前体肽amyA6基因片段通过基因重组的方法构建到PET-28a载体上。利用热激转化的方法将重组载体转入大肠杆菌BL21(DE3)中。

(2)羊毛硫肽前体肽amyA6诱导表达：在液体LB培养基中培养BL21表达菌种，通过添加IPTG诱导羊毛硫肽前体肽amyA6蛋白的异源表达，用8M尿素溶液重悬菌体后，超声破碎菌体，释放羊毛硫肽前体肽amyA6。离心收集上清，使用孔径为1000Da大小的透析袋，透析三天，最后冷冻干燥至粉末状羊毛硫肽前体肽amyA6。

上述羊毛硫肽前体肽amyA6的应用为：羊毛硫肽前体肽amyA6在提高解淀粉芽孢杆菌代谢产物抗菌活性过程中的应用。

优选地，羊毛硫肽前体肽amyA6的添加时期为：解淀粉芽孢杆菌发酵起始至对数生长期末期。

优选地，羊毛硫肽前体肽amyA6的添加量为：解淀粉芽孢杆菌发酵液中加入0.001-10mg/L的羊毛硫肽前体肽amyA6。