[发明专利]一种肉牛繁殖胚胎冷冻保存液及冷冻方法

说明书

本发明属于胚胎学技术领域，提出了一种肉牛繁殖胚胎冷冻保存液及冷冻方法，所述冷冻保存液由以下重量份的组分组成：HPES缓冲液40～50份，牛血清白蛋白0.1～0.5份，山梨糖醇2～5份，谷氨酰胺0.01～0.02份，聚乙烯亚胺10～15份，蔗糖20～25份。肉牛繁殖胚胎冷冻方法，包括下述步骤：将准备冷冻的牛胚胎先在预平衡液中平衡5～8min，再放入权利要求1～3任意一项所述的一种肉牛繁殖胚胎冷冻保存液中平衡30～40秒后转移至冷冻载体上，将冷冻载体投入液氮中进行冷冻。通过上述技术方案，解决了现有技术中冷冻保存液对细胞的冷冻保存效果不好，导致细胞的冷冻存活率低的问题。

技术领域

本发明属于胚胎学技术领域，涉及一种肉牛繁殖胚胎冷冻保存液及冷冻方法。

背景技术

胚胎冷冻保存就是将动物的早期胚胎，采用特殊的保护剂和降温措施进行冷冻，使其在-196℃的液氮中代谢停止或者减弱到足够小的程度，但又不失去升温后恢复代谢的能力，从而能长期保存胚胎的一种生物技术。牛胚胎冷冻保存是由Wilmut在1973年获得成功的。牛胚胎冷冻方法根据降温方法的不同，可以分为缓慢降温法和玻璃化冷冻法。缓慢降温法是指将用冷冻保护剂处理过的胚胎，利用由计算机控制降温速度的胚胎冷冻仪，首先从室温以-1.0℃/min的速度降温至植冰温度-7℃，保持10min，植冰后再以-0.3℃/min的速度降温至-30℃，然后直接投入液氨中长期保存。这种缓慢的降温方法可以防止细胞内结冰或减少冰晶的形成。植冰即诱发结晶，可以有效防止过冷现象对胚胎造成的危害。玻璃化冷冻法是将胚胎用冷冻保护剂处理后，直接投入液氮长期保存。其原理是高浓度的冷冻保护剂在冷却时粘滞性增加，当达到临界值时固化。

无论是缓慢降温法还是玻璃化冷冻法，都必须添加冷冻保护剂。冷冻保护剂可以与水结合，避兔或减少结冰的程度与速度，或仅结成较小的冰晶，同时冷冻保护剂可以降低冷冻过程中由于盐浓度升高而造成的溶质损伤。根据冷冻保护剂能否渗入细胞而将它们分为两类:--类是渗透性保护剂,这类化合物多为低分子化合物，能透过细胞膜，在高的分子浓度下快冻，尤其是慢冻时能保护细胞。这类保护剂主要包括甘油、二甲基亚枫、丙二醇、乙二醇、葡萄糖等；另一类是非渗透性保护剂，主要有蔗糖、聚乙烯吡咯烷酮等。其作用的主要特点是在较快的冷冻及解冻速度中更有效的保护细胞。目前一般多采用联合使用两种以上冷冻保护剂组成冷冻保存液。但是，现有的冷冻保存液对细胞的冷冻保存效果不好，导致细胞的冷冻存活率低。因此，需要对冷冻保存液进行改进，以提高细胞的冷冻存活率。

发明内容

本发明提出一种肉牛繁殖胚胎冷冻保存液及冷冻方法，解决了现有技术中冷冻保存液对细胞的冷冻保存效果不好，导致细胞的冷冻存活率低的问题。

本发明的技术方案是这样实现的：

一种肉牛繁殖胚胎冷冻保存液，所述冷冻保存液由以下重量份的组分组成：

HPES缓冲液40～50份，牛血清白蛋白0.1～0.5份，山梨糖醇2～5份，谷氨酰胺0.01～0.02份，聚乙烯亚胺10～15份，蔗糖20～25份。

作为进一步的技术方案，由以下重量份的组分组成：

HPES缓冲液45份，牛血清白蛋白0.3份，山梨糖醇3份，谷氨酰胺0.015份，聚乙烯亚胺12份，蔗糖23份。

作为进一步的技术方案，所述聚乙烯亚胺的分子量为70000。

一种肉牛繁殖胚胎冷冻方法，包括下述步骤：将准备冷冻的牛胚胎先在预平衡液中平衡5～8min，再放入权利要求1～3任意一项所述的一种肉牛繁殖胚胎冷冻保存液中平衡30～40秒后转移至冷冻载体上，将冷冻载体投入液氮中进行冷冻。

作为进一步的技术方案，在将在预平衡液中平衡5～8min后的牛胚胎放入所述冷冻保存液中前，先将所述冷冻保存液预热至37～40℃。

作为进一步的技术方案，所述冷冻载体为OPS。