[发明专利]高产杆状病毒的东方粘虫蛹卵巢细胞系及其制备方法和应用

说明书

本发明提供了一种高产杆状病毒的东方粘虫蛹卵巢细胞系，该细胞系的名称为IOZCAS‑Myse‑1，其保藏号为CGMCC No.17282。本发明提供了所述高产杆状病毒的东方粘虫蛹卵巢细胞系的构建方法，所述方法包括以下步骤：步骤1)获取东方粘虫卵巢组织；步骤2)培养东方粘虫卵巢组织，至增殖的细胞充满培养瓶，其中，所述组织紧贴在细胞培养瓶底；步骤3)取新增殖的单个细胞，继续培养至细胞传代，即得；整个过程都是在无菌条件下进行的。本发明提供的高产杆状病毒的东方粘虫蛹卵巢细胞系可以用来复制杆状病毒，用于杆状病毒或杆状病毒杀虫剂的规模化生产；该细胞系还可应用于使用构建杆状病毒表达载体系统，表达具有商业或科学价值的蛋白质。

技术领域

本发明属于生物技术领域。具体地，本发明涉及一种昆虫细胞系。更具体地，本发明涉及一种东方粘虫蛹的卵巢细胞系。本发明提供的细胞系对杆状病毒高度敏感。本发明还涉及该细胞系的建立方法，以及该细胞系在杆状病毒规模化生长中的用途。

背景技术

据报道，在1965年第一株昆虫细胞系成功建立后至今，近40年的时间内，已经建立的昆虫细胞系超过700种。它们分别来源于鳞翅目、双翅目、同翅目、膜翅目、直翅目和鞘翅目等170多种昆虫，其中大部分来源于鳞翅目和双翅目昆虫。昆虫细胞系作为研究材料，一直是生理学、发育生物学、细胞生物学、分子生物学和生物化学等科学研究的重要工具，而且昆虫细胞作为杆状病毒表达载体系统的重要组成部分，表达了大量的具有重大经济意义或科学意义的外源蛋白质；同时作为生物反应器，扩增昆虫杆状病毒用作生物杀虫剂，特别是扩增含有外源基因的重组杆状病毒杀虫剂，昆虫细胞也发挥了重要的作用。

大量的来源于鳞翅目昆虫商品化的细胞系已得到人们广泛的应用，比如，来源于草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)的Sf-21和其克隆株Sf-9，来源于粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)的Tn-368和其克隆株Tn-5B1-4(商品名为High Five)等，已经成功的应用于表达和生产重组蛋白。

鳞翅目的细胞系来源于很多组织，包括卵巢、胚胎、血细胞、脂肪体等。然而，值得一提的是，由于昆虫细胞不完全的去分化，有的已经建立的昆虫细胞系仍然保持一定原始组织和器官的特征。来源于不同种类昆虫的细胞系或来源于同一种昆虫不同组织部位的细胞系扩增病毒或重组蛋白的表达能力各有不同。因此建立和筛选新的、更多的杆状病毒敏感细胞系(株)是一项非常有必要而且有理论和实践意义的工作。

到目前为止，来自东方粘虫(Mythimna separata)的细胞系共有约6株(沈立美，刘栖于，1983；裘卫等，1991；Hongchun Yu et al，2003；Guoxun Li et al，2010；XiangqianMeng，2017)1983年，沈立美等东方粘虫血为材料，首先建立了东方粘虫细胞系SIE-Ls-805。1991年，裘卫等同样使用血为材料，得到了细胞系SIE-MSH-805，并检测了该细胞系可以感染苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒和棉铃虫核型多角体病毒。2003年于洪春等和2010年李国勋等分别建立胚胎来源的东方粘虫细胞系NEAU-Ms-980312,NEAU-Ms-941015和NEAU-Ms-947311，这株东方粘虫细胞系可以感染东方粘虫核型多角体病毒。2017年，Meng等建立了胚胎来源的东方粘虫细胞系QAU-Ms-E-10，并克隆了Ms-10C细胞株，该细胞株对苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒和东方粘虫核型多角体病毒较为敏感。

尽管前述文献已有东方粘虫细胞系的有关报道，然而到目前为止，还没有来源于东方粘虫卵巢的细胞系。昆虫的卵巢通常是成对的，是卵子发生和发育的场所。卵巢是由卵巢管(ovariole)组成，在各类昆虫中卵巢管的数目差异很大。自Grace利用卵巢组织建立了第一个昆虫细胞系以来，卵巢一直是细胞系建立的重要组织来源。解剖将要羽化的蛹获得的卵巢组织更易于操作，减少污染机会。更多种类的昆虫细胞系仍存在很大的需求，建立新的来源于昆虫卵巢的细胞系，构建更加高效的杆状病毒表达载体系统是十分有意义的。

发明内容