[发明专利]一种可用于超分辨荧光成像的小分子探针及其制备方法

说明书

本发明公开了一种可用于超分辨荧光成像的小分子探针，其特征在于，所述的小分子探针是通过有机合成的手段对小分子底物进行衍生，再借助链接分子将其与荧光染料分子相连得到，底物分子包括糖分子、氨基酸分子、脂类分子、核苷分子等细胞与外界进行物质交换的小分子底物以及一些配体小分子。本发明的小分子探针，体积小，用于特异性标记细胞膜上相对应的专一性转体蛋白，标记密度高，便于到达每个目标位置；每一种底物都被结合在膜转运蛋白的一个结合位点上，可以体现更为真实的转体蛋白的分布形态，有利于更准确地显示靶分子的分布，制备方法合成成本低、合成时间短、质量更容易得到控制。可广泛应用于相应膜蛋白的定位、分布与组装研究。

技术领域

本发明涉及荧光成像的小分子标记方法技术领域，尤其涉及一种可用于超分辨荧光成像的小分子探针及其制备方法。

背景技术

细胞作为生物体结构和功能的基本单位，其特殊性决定了个体的差异性，因此，对于细胞的深入研究成为了揭示生命奥秘以及克服疾病的关键。细胞膜作为细胞的天然屏障，既维持着细胞内环境的稳定，又调节着细胞与外环境的信号、物质等的交换，在细胞识别、信号转导和酶反应等方面发挥着重要作用。而这些功能的顺利实现需要大量的细胞膜分子的参与。这些膜分子的组装以及相对分布与它们在细胞各个生命活动中的具体功能息息相关。

在众多膜蛋白中，转运蛋白就是其中重要一类，据估计这类蛋白占核基因编码蛋白的15％-30％。他们的分布与组装不仅影响着相应物质的进入与代谢，更与一些疾病的发生密切相关。因此，为了直接高清观察各种蛋白在细胞膜的组装细节以及与各自生物事件相关的单分子生物信息，高分辨的荧光成像技术显得尤为必要。近年来获得快速发展的超分辨荧光成像技术，如基于单分子定位的超分辨显微镜(SMLM)、结构光显微镜(SIM)、受激发射损耗显微镜(STED)等，因其突破了传统荧光成像技术的分辨率极限限制，已经成为了生命化学领域的主要研究手段。

事实上，高质量的荧光成像需要精确的荧光标记。理想的荧光探针——高效、特异地将明亮的荧光团传递至低背景的靶标附近，是提高成像质量的关键。但目前常用的标记技术仍需要在这些特性之间进行权衡。光可激活或光可转换的荧光染料或荧光蛋白是高分辨成像技术最常采用的荧光探针。荧光染料具有尺寸小、亮度高、易于修饰等特点，但是荧光染料自身并不具有靶向性，无法特异性标记目标蛋白，通常需要与一抗或二抗分子连接来提高标记的特异性。2012年，Heilemann课题组通过一抗和带有Alexa647的二抗标记gp210蛋白，成功实现核孔复合物周围gp210蛋白的超分辨成像，并观测到gp210蛋白的八倍对称性(J.Cell.Sci,2012,125,570-575)。我们课题组也先后利用多种抗体探针标记细胞膜上的蛋白分子(例如，Band3、STAT1、GLUT1等)，通过超分辨荧光成像技术研究了这些蛋白分子的组装特点和分布规律。(Nanoscale,2013,5,11582；Sci.Rep-UK,2015,5,9045；Pro.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,2018,115,7033.)。荧光蛋白由于其高特异性标记，也成为了超分辨成像领域常用的标记手段。2006年，Betzig小组利用荧光蛋白标记技术，实现了在固定细胞中对黏着斑蛋白，肌动蛋白以及逆转录病毒蛋白GAG的精确标记以及形态分布(Science,2006,313,1642-1645)。2008年，Schwartz小组，通过结合PALM与活细胞单粒子跟踪技术，运用荧光蛋白标记细胞膜上GAG和VSVG蛋白，实现了单分子运动的超分辨图像，并且获得比传统示踪方法多出多个数量级的单细胞运动轨迹(Nature Methods,2008,5,155-157)。纳米蛋白由于其较小的尺寸，也成为了研究人员关注的焦点。2012年，Ewers小组发展了一种简单、高效、通用的纳米抗体标记方法，通过纳米抗体与荧光蛋白的结合来实现更精确的荧光标记，展示了纳米抗体在超分辨领域的应用前景(Nature Methods,2012,9,582-584)。近几年兴起的核酸适配体(Aptamer)也成为了一种高效的标记方法，Aptamer具有更高的标记特异性。2012年，Rizzoli小组提出了以单链的DNA或者RNA寡核苷酸作为标记探针，实现了转铁蛋白(TRF)，生长因子受体(EGFR)的超分辨成像，揭开了Aptamer在超分辨成像领域的应用(Nature Methods,2012,9,938-939)。