[发明专利]一种iNKT细胞的体外扩增方法

说明书

本发明实施例公开了一种iNKT细胞的体外扩增方法，所述扩增方法包括如下步骤：将DC细胞和iNKT细胞进行混合，得到混合细胞；将混合细胞进行接种、培养。本发明上述扩增方法采取树突状细胞(是机体功能最强的专职抗原递呈细胞)与iNKT细胞混合培养的方式，能够提高iNKT细胞扩增倍数以及提高iNKT细胞释放颗粒酶、穿孔素、IFN‑γ、IL‑2、IL‑4和TNF的能力，在杀伤体内突变细胞的同时修复患者体内的免疫系统，进而提高iNKT细胞的杀伤能力。

技术领域

本发明实施例涉及细胞扩增技术领域，具体涉及一种iNKT细胞的体外扩增方法。

背景技术

随着对肿瘤发生和发展机理和免疫耐受机制研究的不断深入，逐渐意识到自身免疫系统在预防肿瘤的发生和治疗中起到非常重要的作用。人体的免疫系统可以发挥免疫监护功能识别和消灭体内产生的突变细胞，并及时将其清除，避免机体肿瘤的发生。

免疫治疗也逐渐成为继放疗、化疗和手术切除之后治疗肿瘤的第四大模式，为攻克恶性肿瘤带来了曙光。人类恒定性自然杀伤T细胞(iNKT)连接着固有免疫和特异性免疫，在两种免疫方式之间起重要的桥梁作用，通过其特有的免疫应答机制在抗肿瘤免疫及免疫调节中发挥重要的作用，在癌症的免疫治疗中显示出巨大的潜力，对多种肿瘤的发生、发展和扩散起着显著的抑制作用。

iNKT细胞数量和细胞杀伤能力与抗肿瘤效果直接相关，传统使用的白介素2联合α-半乳糖神经酰胺扩增生长的倍数有限(平均100倍)；纯度低(20％-30％)；扩增后的iNKT细胞杀伤功能低下，不能满足临床需求。还有一些采用转染CD8α-白介素21、CD14、CD19、CD86、CD163和CD137L蛋白质的K562细胞(工程细胞)用于扩增iNKT细胞，数量能够满足临床治疗需求，但是存在采取工程细胞制备人类恒定性杀伤T细胞的伦理风险。

发明内容

为此，本发明实施例提供一种iNKT细胞的体外扩增方法，以解决现有扩增方法扩增倍数、纯度、杀伤功能较低以及存在伦理风险的问题。

为了实现上述目的，本发明实施例提供如下技术方案：

根据本发明实施例的第一方面提供一种iNKT细胞的体外扩增方法，其特征在于，包括如下步骤：

将DC细胞和iNKT细胞进行混合，得到混合细胞；

将混合细胞进行接种、培养。

本发明上述扩增方法采取树突状细胞(是机体功能最强的专职抗原递呈细胞)与iNKT细胞混合培养的方式，能够提高iNKT细胞扩增倍数以及提高iNKT细胞释放颗粒酶、穿孔素、IFN-γ、IL-2、IL-4和TNF的能力，在杀伤体内突变细胞的同时修复患者体内的免疫系统，进而提高iNKT细胞的杀伤能力。

进一步地，所述混合细胞中DC细胞与iNKT细胞的数量比为1∶(18-22)。

进一步地，所述接种密度为(1-2)×10⁶个/ml。

进一步地，所述培养采用的培养基为Corning 88-551。

进一步地，所述培养过程中间隔2-3天进行补添培养基，所述补添量与开始培养体积相同。

进一步地，所述培养条件为：温度37℃；CO₂浓度5％；湿度40-60％；培养时间为12-16天。

本发明通过上述具体限定，能够更好地提高iNKT细胞的扩增倍数以及对抗原杀伤性能。

进一步地，所述DC细胞通过如下方法制得：

(a)在外周血中提取单个核细胞；