[发明专利]一种检测结节性皮肤病病毒的RAA引物探针及检测方法

说明书

本发明公开了一种RAA荧光法检测结节性皮肤病病毒的引物、探针及检测方法，其中引物和探针适用于RAA荧光法检测，并且能够准确地检测出结节性皮肤病病毒质粒，与支原体、牛传染性鼻气管炎病毒、牛病毒性腹泻病毒、牛副流感病毒、牛呼吸合胞体病毒、山羊痘病毒、绵羊痘病毒无交叉反应，特异性达100％；检测方法快速、容易实现高通量，同时降低了检测时间和检测成本，本发明提供的基于RAA荧光法快速检测结节性皮肤病病毒DNA的方法，灵敏度高，每反应检测灵敏度达到10copies/反应。

技术领域

本发明属于病毒检测技术领域，具体涉及一种检测结节性皮肤病病毒的RAA引物探针及检测方法。

背景技术

结节性皮肤病(Knopvelsiekte，LSD)是一种牛的痘病，该病和羊痘都是由山羊痘病毒属成员引起的全身性感染疾病；其特征表现为发热，皮肤、黏膜和内脏器官出现结节，机体消瘦，淋巴结肿大，皮肤水肿，有时发生死亡。该病可损坏皮张并降低生产性能，尤其对奶牛损害更大，已被公认为OIE列出的跨境疾病，因而具有重要的经济意义。LSD病毒(LSDV)的基因组包含长大约150,000碱基对(bp)的双链DNA。LSDV和绵羊痘、山羊痘的地理分布不同，LSD的毒株，通常只见于牛；LSDV的传播主要是以节肢动物为媒介。LSD的发病率有一定的季节性，病死率达10％，主要发生在非本地牛。

LSDV的起源未知，历史上，LSD一直是非洲的流行病，然而，由于尚未知的因素，其范围已大幅扩大，自2012年以来，该疾病传播迅速广泛分布于中东、巴尔干地区、高加索和俄罗斯南部地区，由于其发病率高，导致非洲，亚洲，中东，俄罗斯和欧洲经济损失严重。据报道，2019年8月12日，经中国动物卫生与流行病学中心确诊，新疆维吾尔自治区伊犁州发生牛结节性皮肤病疫情，再次引起广泛关注。

在国际控制LSD期间获得的流行病经验表明：一旦在可疑动物中怀疑有皮肤病，及时诊断就会起到关键作用，及早发现病毒对于启动适当的疫情控制措施至关重要。

目前LSD主要诊断方法包括有：

a.现场诊断

严重的羊痘和LSD均有特征性的临床症状。但当两种疾病的症状表现轻微时，就容易与副痘病毒引起的绵羊和山羊传染性化脓性皮炎或牛的伪牛痘和丘疹性口腔炎混淆。大量昆虫叮咬或有荨麻疹时，也可能出现类似羊痘病毒感染的症状。

b.实验室诊断

实验室检测：在活体检测或死后剖检时，可从皮肤丘疹、肺部病变或淋巴结中采集病料，进行病毒分离和抗原检测。利用透射电镜观察典型羊痘病毒颗粒可对羊痘病毒进行实验室确诊。琼脂免疫扩试验(AGID)可以检测沉淀抗原(以羊痘早期病例的活检淋巴结为材料)和特异性免疫血清，但与副痘病毒有交又反应。羊痘病毒可以在绵羊、山羊和牛源组织培养物上生长，尽管野外毒株需要长达14d的生长期，或者需要一种或多种组织培养传代。目前已开发了用多克隆抗血清与重组的羊痘病毒免疫优势抗原反应检测抗原的酶联免疫吸附试验(ELISA)。利用山羊痘病毒针对融合蛋白基因和结合蛋白基因设计的引物进行基因检测的方法也有报道。

病毒中和试验是最特异的血清学检测方法。但由于羊痘病毒感染以细胞免疫为主，因此，当感染病毒动物体内只有低水平中和抗体产生时，中和试验检测就不够敏感。由于与其他痘病毒抗体有交叉反应，AGID和IFAT就不够特异。利用羊痘病毒P32抗原与检测血清进行的免疫印迹试验结果敏感、特异，但成本昂贵，普及困难。

LSD的诊断最初取决于临床症状，可通过病毒分离，电子显微镜检查；也可以通过免疫荧光，血清中和，琼脂凝胶沉淀，抗原捕获ELISA和Dot ELISA等方法确定抗原来进行明确诊断；此外，包括已经用于检测LSDV的常规方法：实时聚合酶链式反应(PCR)。但是所有上述方法都不适合在田间条件下或在检疫站进行，并需要高技能的员工和设备齐全的实验室；基于现有检测技术存在时间长、操作不方便及假阳性高等缺点，提供一种准确、灵敏、操作简便、适用于现场快速检测LSD的RAA荧光法，是本领域技术人员亟需解决的问题。