[发明专利]一种磺酰基转移酶、应用及其介导的氮丙啶环生物合成方法

权利要求书

1.一种利用磺酰基转移酶介导的氮丙啶环生物合成方法，其特征在于：步骤如下：

以3'-磷酸腺苷-5'-磷酸硫酸即PAPS作为磺酰基基团供体基质，以非昔罗霉素前体的结构类似物作为磺酰基基团受体底物，使用磺酰基转移酶进行酶催化反应，具体为：

将底物、PAPS及磺酰基转移酶用PBS缓冲液稀释到相应的浓度：底物浓度为5-50mM、PAPS的浓度为10mM、磺酰基转移酶的浓度为0.1mg/mL-1mg/mL，在25-42℃下反应20min-2h，然后加入0.5mol/L的NaOH调节使体系pH为10.0以上，从而使反应中间体的磺酰基脱落，自身发生亲核取代反应生成氮丙啶环化合物；

所述磺酰基转移酶构建步骤如下：

⑴重组表达载体pET28a(+)-fic28的构建：

以非昔罗霉素磺酰基转移酶基因fic28为目的基因，该基因fic28的基因序列为SEQNO.1，以S.ficellus NRRL8067工程菌株基因组为模板，质粒pET28a(+)为表达载体，设计引物，引物序列为SEQ NO.2、SEQ NO.3，所用酶切位点为NcoI、XhoI，进行PCR扩增；

每50μL目的基因PCR扩增体系及条件如下所示：

PCR反应条件：

得到的目的DNA-fic28先与T-Vector pMD19(Simple)质粒载体连接，切胶回收得到带有酶切位点的目的基因，再与带有相应酶切位点的pET28a(+)载体连接并转化到大肠杆菌JM109中，提取质粒双酶切验证，通过核酸电泳检测；验证正确的质粒测序，将测序正确的重组载体转化到E.coli Rosseta(DE3)表达菌株中，保存菌株以便后续使用；

⑵磺酰基转移酶在E.coli Rosseta(DE3)中的表达纯化及检测：

将携带pET28a(+)-fic28质粒的E.coli Rosseta(DE3)接于LB液体培养基中37℃复苏培养12-16h，再转接到LB液体培养基中37℃扩大培养至OD值＝0.8±0.1，加入诱导剂IPTG进行诱导，诱导剂IPTG的终浓度为0.3-0.7mM，16℃下诱导20-24h，由于表达的磺酰基转移酶为胞内酶，故离心取菌体，经超声破碎后进行SDS-PAGE凝胶电泳检测；将异源表达的磺酰基转移酶进行纯化、浓缩，经过SDS-PAGE凝胶电泳进行检测验证，验证正确即得磺酰基转移酶；

所述步骤⑵中纯化时采用Ni-NTA superflow对表达的目标蛋白进行亲和层析纯化；

所述非昔罗霉素前体的结构类似物的分子结构如下所示：

所述氮丙啶环生物合成方法的合成路线为：

所述PBS缓冲液为：

每1L PBS缓冲液：pH 7.5，称量8g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na2HPO4、0.27g KH2PO4，加入800mL超纯水，充分溶解后定容至1L，0.22μm无菌微孔滤膜过滤。