[发明专利]一种核酸二合一免疫金标速测卡、制备方法及其检测方法

权利要求书

1.一种核酸二合一免疫金标速测卡，包括外壳(1)，所述的外壳(1)中设有检测卡(2)，其特征在于：还包括检测区和控制区，所述的外壳(1)的上部设有观察窗(4)，所述的检测区和控制区分别位于观察窗(4)中，所述的外壳(1)中设有加样孔(3)。

2.根据权利要求1所述的一种核酸二合一免疫金标速测卡，其特征在于：所述的检测卡(2)包括底板(5)，所述的底板(5)上顺次搭接粘贴有样品垫(6)、标记垫(7)、硝酸纤维素膜(8)和吸收垫(9)；

所述的标记垫(7)上涂覆有胶体金标记的抗地高辛抗体；

所述硝酸纤维素膜(8)包括包被有抗生物素抗体的检测线T1(10)、包被有抗FITC抗体的检测线T2(11)和包被有二抗的质控线C(12)。

3.根据权利要求2所述的一种核酸二合一免疫金标速测卡，其特征在于：

所述的标记垫(7)上的抗地高辛抗体的涂覆量为5ng～50ng；硝酸纤维素膜(8)上的抗生物素抗体的量为0.2μg～1.0μ；硝酸纤维素膜(8)上的抗FITC抗体的量为0.2μg～1.0μg。

4.根据权利要求3所述的一种核酸二合一免疫金标速测卡，其特征在于：

所述的标记垫上的抗地高辛抗体的涂覆量为24ng，硝酸纤维素膜上抗生物素抗体的量为0.3μg，硝酸纤维素膜上抗FITC抗体的量为0.45μg。

5.根据权利要求2所述的一种核酸二合一免疫金标速测卡，其特征在于：所述样品垫的大小为3mm×15mm，标记垫的大小为3mm×3mm，硝酸纤维素膜的大小为3mm×28mm，吸收垫的大小为3mm×19mm。

6.根据权利要求1所述的一种核酸二合一免疫金标速测卡的制备方法，其特征在于按以下步骤进行：

(一)、含有检测线T1、T2和控制线C的硝酸纤维素膜的制备：

1)、将生物素抗体用浓度为10mM、pH值为7.4的PBS缓冲溶液稀释到1mg/mL得到生物素抗体溶液，作为检测线T1的包被抗体；

将FITC抗体用浓度为10mM、pH值为7.4的PBS缓冲溶液稀释到1.5mg/mL得到T抗原溶液，作为检测线T2的包被抗体；

羊抗鼠IgG二抗溶液为将羊抗鼠IgG二抗溶于浓度为10mM、pH值为7.4的PBS缓冲溶液中，且羊抗鼠IgG二抗浓度为1mg/ml；

2)、包被：

选取PALL170的硝酸纤维素膜用划膜喷金机将浓度为1.0mg/mL的生物素抗体溶液以1.0μL/cm划T1线，作为检测线T1；

将浓度为1.5mg/mL的FITC抗体溶液以1.0μL/cm划T2线，作为检测线T2；

浓度为1mg/mL的羊抗鼠IgG二抗溶液以1.0μL/cm划C线，作为质控线C；

在温度为37℃的环境下，烘干24小时，待用；得到包被抗原的硝酸纤维素膜；

(二)、固定有胶体金标记的特异性单克隆抗体的金标垫的制备：

1)、胶体金制备：

a)准备：将500mL烧杯、20mL小烧杯、转子、棕色瓶、玻璃棒洗净后放入酸缸中浸泡24小时；

取出先用自来水冲洗3～4次，再用超纯水冲洗3～4次，置于37℃烘箱中烘干备用；

b)烧金溶液A的配置：用塑料称量匙称取1g氯金酸粉末于棕色瓶中，加入99ml超纯水充分溶解，在温度为4℃的环境中避光保存；

c)烧金溶液B的配置：称取1g柠檬酸三钠溶解于99ml超纯水中，混匀。

d)胶体金的制备：量取99ml超纯水于烧杯中，加入1ml烧金溶液A，置于恒温磁力搅拌器上搅拌混匀，开启加热至溶液沸腾，迅速加入2ml新制备的烧金溶液B，继续搅拌加热，溶液逐渐变为蓝黑色，然后紫黑，再加热出现红色，继续沸煮出现透明的橙红色，继续沸煮10min，自然冷却至室温，加超纯水定容至100ml；倒入棕色瓶，在温度为4℃的环境中避光保存；得到胶体金溶液；

2)、抗体标记：

e)抗体的标记：取1.5ml上述步骤(二)的d)中制取好的胶体金溶液，用0.1M的K2CO3调节pH值，分别加入20ug地高辛单克隆抗体，混合均匀，室温反应40min；加入10％的BSA终止，静置30min；

f)标记抗体纯化：先用低速离心上述静置产物，弃去由凝聚的金胶粒形成的沉淀，收集上清液；再用高速离心30分钟，仔细吸去上清液，收集沉淀，用含质量百分含量为1％BSA的0.1M PBS、PH7.4进行复溶沉淀，在温度为4℃的环境中进行保存；得到地高辛抗体标记胶体金溶液，浓度为0.4mg/ml；

3)、喷金：

将上述步骤(二)的f)中制备的地高辛抗体标记胶体金溶液0.4mg/ml稀释到0.04mg/ml，以2.0μL/cm喷于预处理过的金标垫试纸条，烘干待用，得到固定有胶体金标记的特异性单克隆抗体的金标垫试纸条；

(三)、核酸二合一免疫金标速测卡的组装：

在上层的塑料板有两个的孔，分别为加样孔和观察孔，加样孔大小为3mm×7mm，观察孔大小为3mm×18mm；

在塑料板下方从加样孔往上依次为并排粘贴的：玻璃纤维膜作为样品垫、上述步骤(二)的f)中制备的固定有胶体金标记的特异性单克隆抗体的金标垫试纸条，上述步骤(一)的2)中制备的包被抗原的硝酸纤维素膜和吸收垫；然后置于在环境为37℃的环境下真空干燥30min，得到核酸二合一免疫金标速测卡。