[发明专利]基于标签表面增强拉曼散射检测细菌的方法

说明书

本发明公开了一种基于标签表面增强拉曼散射检测细菌的方法。其采用IgG修饰的磁珠进行细菌的富集和捕获，采用硼酸化的SERS标签（Au@Ag@PDA）附着在目标细菌表面用于信号的放大，从而使得细菌的拉曼光谱信号增强了10⁸倍左右，显示出独特的指纹图谱。本发明进一步采用PCA和HCA比较不同拉曼光谱区域，结果表明细菌表面蛋白和聚糖信号是细菌分类的最佳区域。本发明对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、痢疾志球菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯氏菌等5种细菌进行了分类，检测灵敏度达10¹CFU/mL，检测时间小于30min。本发明方法稳定性好，操作简便，成本低且适用性广，可推广到临床和食品安全中的细菌的检测或分类。

技术领域

本方法应用于微生物检测分析技术领域，涉及一种基于标签表面增强拉曼散射检测细菌的方法。

背景技术

细菌以其巨大的多样性和复杂性存在于生命环境中，细菌的分类是细菌鉴定的第一步，开发快速、灵敏和准确的细菌诊断方法是保障公众以及动物健康的主要目标。传统的细菌检测有革兰氏染色和血清分型方法，然而这两种方法操作复杂且都很耗时。新近发展起来的一些分子生物学如聚合酶链反应(PCR)、酶联免疫吸附试验酶链反应(ELISA)、第二代测序(NGS) 等，这些方法虽然可以达到高特异性和灵敏度，但都需要繁琐的操作过程，不适于现场检测。近五年来基质辅助激光解析飞行时间质谱在临床微生物鉴定中应用十分广泛，其鉴定微生物的主要依据是微生物核糖体蛋白的差异，不同质量的核糖体蛋白在质谱中呈现特异性的指纹谱。虽然低成本，操作简便使MALDI-TOF质谱成为细菌鉴定和分类一个极具吸引力的选择，然而这种测定方法需要昂贵的设备以及无法脱离细菌分离培养的耗时过程。与此相比，分子光谱，如红外光谱和拉曼光谱，都可以快速扫描得到微生物的指纹图谱。但因为红外光谱对水极度敏感，从而限定了它在微生物范畴的应用，而拉曼光谱可以提供与红外光谱互补的微生物的指纹信息，而且它不受水的影响，这使得拉曼光谱在微生物检测中的应用前景良好。

表面增强拉曼散射（Surface-Enhanced Raman Scattering，简称SERS）是一种具有单分子灵敏度的振动光谱技术。目前基于SERS检测细菌的方法分为以金、银等贵金属为增强基底直接获得细菌的拉曼指纹图谱和通过拉曼标签（SERS tag）标记后检测细菌两大类。前一种方法利用表面增强拉曼直接获得细菌指纹谱图，而后一种通过间接检测具有很强的拉曼信号标签来检测细菌。本发明中结合这两种方法的优势，采用标签将细菌的信号放大同时也能直接获取细菌指纹图谱。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种快速、方便、低成本、高灵敏的表面增强拉曼散射（SERS）检测细菌的方法。 本发明公开了IgG修饰的磁珠和硼酸化的SERS标签的制备方法，并基于这两种材料的联用实现细菌的快速捕获及SERS检测。

本发明中采用IgG修饰的Fe₃O₄磁珠IgG@Fe₃O₄进行细菌的捕获与分离，采用硼酸化的SERS标签附着在目标细菌表面用于细菌信号的放大，在这个过程中形成IgG@Fe₃O₄-细菌-SERS标签的三明治式的纳米传感器进一步富集增强细菌拉曼信号，从而显示出独特的指纹图谱。本发明进一步将得到的细菌特异性的指纹图谱进行主成分分析(PCA)和层次聚类分析(HCA)，通过比较不同拉曼光谱区域，发现不同细菌的指纹SERS图谱的差异，实现对细菌的检测。

本发明的技术方案具体介绍如下。

本发明提供一种基于标签表面增强拉曼散射检测细菌的方法，包括如下步骤：

1) 将IgG修饰的Fe₃O₄磁珠IgG@Fe₃0₄添加到测试细菌样品中孵育，用于细菌的捕获与分离；