[发明专利]一种烟草新烟碱合成调控基因NtERF91的克隆和应用

说明书

本发明公开了烟草新烟碱合成调控基因NtERF91及其克隆方法与应用，烟碱合成调控基因NtERF91核苷酸序列如SEQ ID：No.1所示，编码的氨基酸序列如SEQ ID：No.2所示。本发明还公开了新烟碱合成调控基因NtERF91的克隆方法，具体步骤包括：A、确定NtERF91基因序列；B、提取烟草RNA，反转录得到第一链cDNA；C、根据NtERF91基因序列设计合成特异性引物，以cDNA作为模板，进行PCR扩增；D、回收和纯化PCR产物；E、构建了含NtERF91基因的过表达载体。将过表达载体通过农杆菌介导的转化在烟草中过表达，制备转基因植株。获得的转基因植株新烟碱含量是对照的4倍以上。说明烟草NtERF91基因在培育高新烟碱含量的烟草方面具有较大的应用前景。

技术领域

本发明属于遗传工程技术领域，具体涉及一种烟草新烟碱合成调控基因NtERF91的克隆方法与应用。

背景技术

新烟碱是茄科植物(如烟草、番茄)中的一种生物碱。在烟草中，新烟碱在烟草总生物碱中的比例较低。烟草生物碱占烟草总干重的2％-4％。在烟草四种生物碱当中，烟碱占到了总生物碱的95％左右，新烟碱、降烟碱以及假木贼碱仅占剩余的5％。在自然界当中，这些烟草生物碱类化合物具有生物活性，在烟草防御系统当中作为天然毒素来防御昆虫或食草动物的捕食。

新烟碱经常在动物模型和细胞系中被用于研究其是否对可以治疗烟碱致瘾性、阿尔茨海默病、甲状腺炎、多发性硬化症、以及抑制乙酰胆碱受体活性。在烟草生物碱次生代谢方面，ERF(Ethylene Response Factor)类型的转录因子基因被认为是烟草中调控烟碱合成重要调控因子(Rushton et al.,2008,Plant Physiology,147:280-295)。调控烟碱合成的NIC2遗传位点已被发现是由至少7个ERF基因组成，如NtERF189，NtERF179等(Shoji etal.,2010，Plant Cell,22:3390-3409)。这些ERF转录因子属于ERF家族中I的X亚族，它们可以通过直接结合烟碱合成途径中关键代谢限速酶基因(如NtPMT、NtQPT)的启动子中的GCC-box来转录激活该基因的表达，进而增强烟碱的合成与积累(Shoji et al.,2010，PlantCell,22:3390-3409)。然而，新烟碱在烟草悬浮细胞系中主要积累，主要原因是由于烟碱合成途径中的MPO代谢酶表达量在悬浮细胞系中表达偏低造成的(Shoji和Hashimoto,2008,Plant Cell Physiology，49:1209-1216)。另一方面，新烟碱作为烟草生物碱当中积累量较少的生物碱，针对调控其代谢和积累的转录调控因子基因尚未见报道。

由于新烟碱在医学方面的功效，科学家正开展利用生物技术手段提高烟草烟碱含量进行研究，从而增加烟草的商业用途，也为降低新烟碱原料的生产成本。目前，我国也亟需深入研究研究新烟碱的合成调控机理，为培育新烟碱含量高烟草品种提供理论基础。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种烟草新烟碱合成调控基因NtERF91；第二目的在于提供所述的烟草新烟碱合成调控基因NtERF91的克隆方法；第三目的在于提供所述的烟草新烟碱合成调控基因NtERF91的应用。

本发明的第一目的是这样实现的，所述的烟草新烟碱合成调控基因NtERF91的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示。

本发明的第二目的是这样实现的，包括以下步骤：

A、确定NtERF91基因序列；

通过分析茉莉素处理烟草根部组织的转录组数据，获得受茉莉素正向调控ERF家族基因1个，序列比对发现该基因为NtERF91。根据该基因序列设计基因克隆引物：

正向引物NtERF91-BamH I：

GGATCCATGTTAACTAGTGTCAATACCACGT；