[发明专利]一种烟草降烟碱合成调控基因NtERF91的克隆和应用

说明书

本发明公开了烟草降烟碱合成调控基因NtERF91及其克隆方法与应用，降烟碱合成调控基因NtERF91核苷酸序列如SEQ ID：No.1所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID：No.2所示。本发明还公开了降烟碱合成调控基因NtERF91的克隆方法，具体步骤包括：A、确定NtERF91基因序列；B、提取烟草RNA，反转录得到第一链cDNA；C、根据NtERF91基因序列设计合成特异性引物，以cDNA作为模板，进行PCR扩增；D、回收和纯化PCR产物；E、构建了含NtERF91基因的过表达载体。将过表达载体通过农杆菌介导的转化在烟草中过表达，制备转基因植株。结果显示，转基因植株的上部、中部、下部烟叶中降烟碱含量分别相比对照增加了2.4倍、1.6倍和1.8倍，说明烟草NtERF91基因在培育高降烟碱含量的烟草方面具有较大的应用前景。

技术领域

本发明属于遗传工程技术领域，具体涉及一种烟草降烟碱合成调控基因NtERF91的克隆方法与应用。

背景技术

烟草(Nicotiana tabacum)是重要的经济作物，是茄科一年生草本植物。降烟碱是栽培烟草重要的特征化合物，占烟草总生物碱的95％左右。

ERF(Ethylene Response Factor)类型的转录因子基因是普通烟草中调控降烟碱合成重要调控因子。烟草中调控降烟碱合成的NIC2遗传位点已被发现是由至少7个ERF基因组成，如NtERF189，NtERF179等。今年来，随着基因组和测序技术的发展，ERF类转录因子对降烟碱合成调控的分子机理也逐渐清晰。根据相关报道，烟草ERF转录因子家族中IX亚族中的ERF(NIC2位点)转录因子可以通过直接结合降烟碱合成途径中关键代谢限速酶基因(如NtPMT、NtQPT)的启动子中的GCC-box来转录激活该基因的表达，进而增强降烟碱的合成与积累。

国际上一些知名烟草公司和相关烟草研究机构正在开展利用生物技术手段提高烟草降烟碱含量进行研究，用来积极应对新型烟草制品原料的需求，从而提高烟草品质，也为降低电子烟等产品的降烟碱原料生产成本。目前，我国也亟需深入研究研究合成调控机理，为培育高降烟碱低焦油烟草品种提供理论基础。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种烟草降烟碱合成调控基因NtERF91；第二目的在于提供所述的烟草降烟碱合成调控基因NtERF91的克隆方法；第三目的在于提供所述的烟草降烟碱合成调控基因NtERF91的应用。

本发明的第一目的是这样实现的，所述的烟草降烟碱合成调控基因NtERF91的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示。

本发明的第二目的是这样实现的，包括以下步骤：

A、确定NtERF91基因序列；

通过分析茉莉素处理烟草根部组织的转录组数据，获得受茉莉素正向调控ERF家族基因1个，序列比对发现该基因为NtERF91。根据该基因序列设计基因克隆引物：

正向引物NtERF91-BamH I：

GGATCCATGTTAACTAGTGTCAATACCACGT；

反向引物NtERF91-Xho I：CTCGAGTCAATTTTCAGCCAATTTTCTCTTC；

B、提取烟草根组织RNA，反转录得到第一链cDNA；

C、以反转录得到的第一链cDNA作为模板，利用NtERF91基因克隆引物进行PCR扩增，回收和纯化PCR产物；