[发明专利]一种兽用水溶性壳聚糖脂质体佐剂的制备方法

说明书

本发明公开了一种兽用水溶性壳聚糖脂质体佐剂的制备方法，本发明的佐剂包括磷脂、胆固醇、蜂胶、壳聚糖盐酸盐、戊二醛，通过本发明制备得到的兽用水溶性壳聚糖脂质体佐剂粒径小，均一性好，具有较好的热稳定性和良好的细胞相容性，贮存稳定性高，久置不分层，极大消除了佐剂中有机溶剂残留的风险，可以延长高水平抗体在体内的维持时间。

技术领域

本发明属于兽用疫苗佐剂技术领域，尤其涉及一种兽用水溶性壳聚糖脂质体佐剂的制备方法。

背景技术

免疫佐剂可辅佐免疫原刺激机体产生较早、较强、持久的免疫应答，佐剂大致可分为两类，第一类是抗原载体，例如乳剂类和脂质体等，能够以更有效的方式提呈抗原进入免疫系统，第二类为免疫刺激剂，如Toll样受体（TLR）、氢氧化铝、皂苷和细胞因子等。随着生物技术的发展，一些新型佐剂随着时代的需要逐步出现，其中壳聚糖及其衍生物由于具有良好的可生物降解性、低毒性、免疫刺激活性、缓释作用及靶向性，已成为了构建疫苗免疫佐剂的优良载体。

铝盐作为经典的传统佐剂应用于临床已经有80多年，也是至今唯一被FDA批准可用于人类疫苗的佐剂，它能有效的诱导体液免疫应答，但对细胞免疫不起作用。油乳佐剂分为水包油、油包水乳剂和水包油包水双相乳剂，其中最著名的属弗氏佐剂（Freund’sadjuvant，FA），但该佐剂易引起注射部位的炎症或肉芽肿等不良反应。传统佐剂的局限性使得纳米佐剂等一系列新型佐剂得到飞速发展，而脂质体作为一种纳米传送体系，不仅拥有纳米佐剂的优势，还能够同时刺激体液和细胞免疫，使疫苗的免疫效果增强数十倍。

同时，与其他佐剂制剂相比，脂质体制剂对制备条件的变化更为敏感。

由于脂质体属于热力学不稳定体系，随着时间推移，粒子大小和分布会朝较大粒子方向发展，即出现颗粒聚集或沉降。

目前市售的兽用脂质体佐剂存在如下问题：粒径较大，均一性差，稳定性差，热力学稳定性不好，久置易分层，佐剂中有机溶剂残留的风险较高，高水平抗体在体内的维持时间短。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种兽用水溶性壳聚糖脂质体佐剂的制备方法，通过本发明制备得到的兽用水溶性壳聚糖脂质体佐剂粒径小，均一性好，具有较好的热稳定性和良好的细胞相容性，贮存稳定性高，久置不分层，极大消除了佐剂中有机溶剂残留的风险，可以延长高水平抗体在体内的维持时间。

为实现上述目的，所采取的技术方案是：

一种兽用水溶性壳聚糖脂质体佐剂的制备方法，包括如下步骤：

（1）将磷脂和胆固醇均溶解在三氯甲烷中混合后得到混合溶液A；

（2）按照蜂胶：95％的乙醇=1kg：（15-25）L的比例，将蜂胶溶于95％的乙醇中配制成蜂胶乙醇溶液；

（3）步骤（1）中得到的混合溶液A与步骤（2）中得到的蜂胶乙醇溶液按照体积比1：（1-3）进行均匀混合，得到混合溶液B；

（4）将步骤（3）中得到的混合溶液B转移至旋转蒸发仪中，进行真空旋转蒸发除去有机溶剂，旋转蒸发仪烧瓶内壁形成脂质膜；

（5）用去离子水洗下步骤（4）中旋转蒸发仪烧瓶内壁的脂质膜，混匀溶液后得到混合溶液C；

（6）使步骤（5）中得到的混合溶液C在40-60℃温度下、在功率150-250W的超声处理下、在压力为12-16Mpa的二氧化碳气氛下孵化0.5-1.5h，得到蜂胶脂质体溶液；

（7）将壳聚糖盐酸盐用去离子水溶解后制得壳聚糖盐酸盐溶液，壳聚糖盐酸盐溶液与步骤（6）中制得的蜂胶脂质体溶液按照等体积比例进行均匀混合，在（500-700）r/min的条件下结合0.5-1.5h；