[发明专利]一种阿拉伯低聚木糖粉的生产方法

权利要求书

1.一种阿拉伯低聚木糖粉的生产方法，其特征在于，步骤如下：

1)小麦绿麦芽的制备：用16℃的水浸泡小麦，水量完全没过小麦，每浸泡2小时就将水放掉，断水4小时，浸麦和断水期间均以15min/h通风，当浸麦度达到45％时浸麦结束，在13～15℃的温度下避光发芽5天，得到绿麦芽；

2)小麦芽内切-β-1,4-D-木聚糖内切酶的纯化：

a)粗酶的提取：将步骤1)制备得到的绿麦芽打浆，取绿麦芽浆m，4℃条件下，与0.05MpH 7.0磷酸盐缓冲液按照1：3的质量比混合并且搅拌30min，5000rpm离心，取全部上清液，用0.45μm的膜进行过滤上清液，收集滤液，得到粗酶液；

b)硫酸铵沉淀：4℃搅拌条件下，取全部粗酶液，量取粗酶液体积为n，按照258g/L的比例向粗酶液中缓慢加入硫酸铵，搅拌90min，5000rpm离心，取沉淀；用0.05M pH 5.5磷酸盐缓冲液将沉淀复溶至体积为步骤a)中所述绿麦芽浆质量m的五分之一，用0.05M pH 5.5磷酸盐缓冲液作为透析液进行透析，透析袋截留分子量3500Da；每隔4h换一次透析液，透析48h；收集透析的酶液，测定酶液体积为P₁，蛋白质含量为Q₁；

c)SP-Sepharose Fast Flow阳离子层析：首先确定阳离子层析柱填料体积V₁＝P₁×Q₁/填料蛋白载量g/L。填料体积V₁不足200mL时填充200mL；填好柱材后，用体积为4V₁经0.45μm的滤纸膜滤的0.05M pH 5.5磷酸盐缓冲液平衡阳离子交换层析柱，流速为0.01V₁mL/min；将步骤b)中透析后的酶液离心，0.45μm的滤纸膜滤，上样；用体积为V₁的0.05M pH 5.5磷酸盐缓冲液洗脱，收集在280nm处紫外检测器有吸收峰的酶液；4℃条件下，分别用0.05M pH7.0磷酸盐缓冲液和0.05M pH 8.3Tris-HCl缓冲液依次作为透析液透析酶液，每隔4h换一次透析液，透析48h；收集透析的酶液，测定酶液为P₂，蛋白质含量为Q₂；

d)Q-Sepharose Fast Flow阴离子层析：首先确定阴离子层析柱填料体积V₂＝P₂×Q₂/填料蛋白载量g/L，填料体积V₂不足200mL时填充200mL；填好柱材后，用体积为4V₂的经0.45μm的滤纸膜滤的0.05M pH 8.3Tris-HCl缓冲液平衡阴离子交换层析柱，流速为0.01V₂ mL/min；将步骤c)中收集的透析后的酶液用0.45μm的滤纸膜滤，上样；分别用体积均为V₂的含有0mol/L和0.1mol/L NaCl的0.05M pH 8.3Tris-HCl缓冲液洗脱，然后继续用含有0.2mol/L NaCl的0.05M pH 8.3Tris-HCl缓冲液洗脱，并收集在280nm处0.2mol/L NaCl浓度下紫外检测器有吸收峰的酶液；4℃条件下，用0.05M pH 8.3Tris-HCl缓冲液作为透析液透析酶液，每隔4h换一次透析液，透析24h；收集透析的酶液，测定酶液体积为P₃，蛋白质含量为Q₃；

e)Source 30Q阴离子层析：首先确定阴离子层析柱填料体积V₃＝P₃×Q₃/填料蛋白载量g/L,填料体积V₃不足200mL时填充200mL；填好柱材后，用体积为2V₃的经0.22μm的滤纸膜滤的0.05M pH 8.3Tris-HCl缓冲液平衡阴离子交换层析柱，流速为0.01V₃ mL/min；将步骤d)中透析后的酶液用0.22μm的滤纸膜滤，上样；分别用体积为2V₃的含有0mol/L、0.1mol/L、0.2mol/L NaCl的0.05M pH 8.3Tris-HCl缓冲液洗脱，然后继续用含有0.3mol/L NaCl的0.05M pH 8.3Tris-HCl缓冲液洗脱，并收集在280nm处0.3mol/L NaCl浓度下紫外检测器有吸收峰的酶液；4℃条件下，分别用0.05M pH 7.0磷酸盐缓冲液和0.05M pH 5.5磷酸盐缓冲液透析酶液，每隔4h换一次透析液，透析12h；得到纯化的小麦芽内切-β-1,4-D-木聚糖内切酶即为降解酶液；

3)阿拉伯低聚木糖粉的制备：

a)用降解酶液降解小麦源阿拉伯木聚糖：将水配的阿拉伯木聚糖溶液，与步骤2)制备的降解酶液以体积比6：1混合，混合溶液的阿拉伯木聚糖浓度为0.5mg/mL；在40℃反应6h，煮沸15min终止反应，然后8000rpm离心10min，收集上清液并用0.45μm的滤纸膜滤，得到酶解液；酶解液体积记作V₄；

b)制取阿拉伯低聚木糖粉：向酶解液中缓慢加入体积为4V₄的无水乙醇，使酶解液中乙醇浓度达到80％，涡旋混合，4℃放置过夜，8000rpm离心10min，收集上清液a；将沉淀用去V₄体积的离子水复溶，再次醇沉，静置，离心并且收集上清液b，将上清液b和上清液a合并；40℃条件下，将合并后的上清液干燥3小时以去除乙醇，然后冻干得到阿拉伯低聚木糖粉。