[发明专利]体外构建肌腱组织的方法及其生物材料和应用

说明书

一种体外构建肌腱组织的方法，对细胞施以电刺激，使细胞发生迁移、排列、增殖和成肌腱分化，提高所构建肌腱组织的力学强度。本发明提供的方法，可具有电活性，受外力的牵拉能产生电信号的生物材料制成支架，将细胞接种其上，体外培养，使得支架上的细胞形成肌腱组织，再植入动物体内成熟，最后成熟的肌腱用于修复肌腱组织缺损。

技术领域

本发明涉及一种制取用于组织修复的材料，尤其涉及一种体外构建肌腱组织的方法，以及利于构建肌腱的生物材料，及其在肌腱修复中的应用。

背景技术

肌腱是高度分化的纤维组织，其主要作用是传递肌肉与骨骼之间的机械应力。传统的肌腱缺损修复方法主要采用自体肌腱移植、同种异体肌腱或人工肌腱替代等方法，这些方法存在诸多弊端，例如：引起供区功能障碍、机体排异反应和降解后生物力学下降等。

肌腱是一种富含胶原的致密结缔组织，具有较好的生物力学性能。这种特性与胶原纤维的分层组合结构密切相关(Proc Inst Mech Eng H.2004，218(2)：109)。胶原纤维聚集成束被腱内膜包绕形成初级结构，再逐步聚合形成二级和三级结构，最终形成肌腱组织(J Cell Biol，2000，151(4)：779)。模拟胶原成熟的组织微环境在构建组织工程化肌腱过程中至关重要。以往研究(包括我们的研究)表明特定的生长因子，如：BMP、GDF和TGF-β，单向牵张力刺激以及狭长细胞形态维持等，是模拟肌腱再生微环境的重要因素。Shen等人发现BMP-12可以激活ASCs中的Smad信号通路诱导脂肪干细胞向肌腱细胞分化，有效增强肌腱标志物SCX和TNMD的基因和蛋白表达水平(PLoS One.2013，8(10)：e77613)。Park等发现GDF-5可以促进ASCs的增殖(Tissue Eng Part A.2010，16(9)：2941)，提高细胞外基质(COLLI、decorin、ACAN)和肌腱细胞标志物(SCX、Tnmd、tenascin-C)的表达。Hurle等人证实肌腱细胞体外培养过程中添加TGF-β可以促进细胞增殖和胶原合成(J Biol Chem，2009，284(43)：29988)，TGF-β也可以通过Smad通路来上调Scleraxis和Tenomodulin的表达。Oakes等发现周期性张力促进肌腱愈合的机制(Med J Aust，2004，180(5Suppl)：S35)，主要是通过提高各类生长因子的含量从而促进细胞增殖、分化，基质形成。Tong等利用牛跟腱冰冻切片作为模板观察其对人MSC成肌腱诱导的作用(Biomaterials，2012，33(31)：7686)，结果显示只有在纵向切片上MSC因为表面胶原纤维纵向排列的拓扑结构而转化为狭长形态并向肌腱细胞分化。同时发现静态力学刺激较无力学刺激能更有助于细胞胶原分泌、纵向排列以及增增强胶原的重塑和成熟，而动态单向力学刺激较静态力学刺激能更有效促进胶原纤维形成与重塑和肌腱结构的形成(Tissue Eng Part A.2008，14(10)：1615)。

中国发明专利201510005188.3公开了一种三维平行胶原纤维-蚕丝支架，由编织蚕丝基架和包覆在编织蚕丝基架上、下方表面的平行胶原纤维层构成，编织蚕丝基架是由蚕丝编织成网孔大小为0.25～25mm²的网片结构，平行胶原纤维的孔隙直径大小为10～300μm，编织蚕丝是去除了丝胶蛋白的编织蚕丝；支架生物相容性好，力学性能佳，支架的拓扑结构与肌腱/韧带相似，能够促进其表面生长的干细胞向肌腱/韧带分化，促进肌腱/韧带再生。

中国发明专利申请201910073913.9公开了一种利用熔融电纺三维打印与同轴纺丝制备腱骨联合三相支架，由种子细胞的培养、肌腱支架的制备和细胞的种植等步骤制得。通过结合熔融静电纺丝三维打印和同轴纺丝技术，使得熔融静电纺丝三维打印技术可以极大地提高打印精度，易于控制纤维直径与打印路径，而同轴纺丝技术则可使我们获得内层含有细胞因子的双层纤维，通过不同的路径参数，直接获得肌腱-软骨-骨三相支架，该制作方法简单方便，同时携带大量细胞因子进行缓释，可促进细胞增殖修复，利于腱骨联合修复及正常功能恢复。

发明内容