[发明专利]用于双氧水和末端转移酶检测的电化学传感器及应用

说明书

本发明公开了基于G4堆叠自组装体的电化学方法及其在双氧水和末端转移酶检测中的应用，具体步骤如下：(1)金电极预处理；(2)Electrode 1：滴加DNA1，常温放置；(3)Electrode 2：在Electrode 1上滴加反应混合液，孵育使DNA1延长生成随机排布的富G的DNA长链。在电极上滴加KCl溶液；(4)Electrode 3：在Electrode 2上滴加混合液【MgCl₂+G4链】，常温下放置形成G4堆叠自组装体。滴加hemin，常温下放置使G4与hemin充分作用形成具有辣根过氧化物酶活性的G4‑hemin复合物，即为过氧化氢电化学生物传感器。改变过氧化氢浓度或TdT浓度，探究所制备的一系列传感器对电化学信号的影响。优点是特异性好、灵敏度高、检测速度快、结果准确可靠、成本低。

技术领域

本发明涉及一种信号放大的电化学方法，尤其是涉及一种基于G4堆叠自组装体的电化学方法及其在双氧水和末端转移酶检测中的应用，属于功能生物材料和生物传感技术领域。

背景技术

鸟嘌呤四链体是一种高度折叠的核酸结构，包括了多个连续堆叠的鸟嘌呤平面。这些独特的结构参与了基因的正反馈和负反馈调节，以及保持端粒的稳定性和作为化学治疗中的抗癌靶向分子。除了鸟嘌呤四链体自身在生命中有着重要的意义，其结合hemin 形成复合物具有的过氧化物酶性质也吸引了很多科学工作者的关注。这种具有过氧化物酶活性的DNA酶可以作为信号产生者检测各种目标，比如金属离子、小分子、核酸、蛋白质和活细胞等。由于DNA的合成保存条件简单，使用条件温和，这类DNA酶被广泛应用于各种生物分析中。

过氧化氢(H₂O₂)在多种领域中具有重要作用，如各种有机化合物、食品和农业、制药、生物、临床、环境和化学工业以及燃料电池的合成。因此，值得努力开发一种快速、简便、准确、可靠的H₂O₂测定方法。已经使用许多分析方法来测定H₂O₂，例如滴定法、分光光度法、化学发光法、色谱法和电化学法。其中，由于其价廉、有效、简单和高灵敏度的特性，电化学方法获得广泛的关注。然而，在裸电极上直接氧化或还原H₂O₂具有诸如缓慢的电子转移动力和氧化还原反应的高过电位的缺点。

一种独特的DNA聚合酶，称为末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)。TdT可在不涉及模板的情况下催化聚合。TdT产生的DNA序列是非特异性的并且几乎是随机的，而且它们的序列组成很大程度上取决于底物脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)库的构成。因此，可以预期通过TdT聚合使用G获得随机排列的富G序列。丰富的dNTP池。另一方面， TdT的病理学意义已经通过胚细胞中的TdT活性作为重要的生物标志物这一事实得到证实。此外，TdT被广泛用作标记DNA末端，DNA末端快速扩增(RACE)和凋亡细胞检测的分子生物学工具。传统的TdT检测依赖于生化分析、免疫分析和凝胶电泳。然而，所有这些方法都需要放射性或荧光标记的DNA或核苷酸以及涉及的多步骤检测，这是耗时、耗力、且昂贵的。因此，开发简便的无标记方法以监测TdT的活性仍然是一个挑战。

本发明提出了一种基于G4堆叠自组装体的电化学方法，通过TdT聚合制备随机富含G的DNA序列的简便方法，并证明这种随机富含G的DNA能够形成G-四链体。巯基修饰的DNA探针(DNA1)通过金-硫键组装在金电极上，利用TdT催化dGTP和 dATP随机引入DNA末端，然后用钾离子诱导形成游离的G-四链体单体溶液使之在电极上随机形成N个G-四链体结构。在镁离子的存在下的缓冲溶液中，引入新的特定序列G-四链体(DNA2)快速在延伸链上随机堆叠形成G4堆叠自组装体，G4堆叠自组装体通过与hemin的结合，可以形成具有类辣根过氧化物酶催化性能的DNA酶，通过过氧化氢(H₂O₂)在3，3′，5，5′-四甲基联苯胺(TMB)存在下发生化学反应产生电化学信号。目前，国内外尚未发现基于G4堆叠自组装体的H₂O₂和TdT电化学传感策略的相关报导。

发明内容