[发明专利]利用生物反应器悬浮培养、保存和复苏BHK21细胞的连续生产方法及其应用

权利要求书

1.一种利用生物反应器低温保存BHK21细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)将在生物反应器中悬浮培养的BHK21细胞低温保存于该生物反应器中；

生物反应器低温保存BHK21细胞的条件为：温度：4-6℃，pH值：7.0-7.5，溶氧浓度：40％-60％，搅拌转速：0rpm。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括以下步骤：

2)在所述生物反应器中经低温保存的BHK21细胞沉降后进行排上清处理，再流加更换新的营养液，所述营养液与悬浮培养BHK21细胞的营养液相同，优选营养液配方为B21-JY培养基加2-5％血清；

3)对步骤2)更换新的营养液后的细胞液进行培养至细胞活力在90％以上，获得复苏悬浮细胞液；

4)将步骤3)获得的复苏悬浮细胞液通过所述生物反应器进行降温并低温保存；

5)重复步骤2)、步骤3)和步骤4)的操作N次，其中N为≥0的自然数。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤2)中所述排上清处理的具体操作方法为：向所述生物反应器中增加压力，将上清从所述生物反应器上方提清口排出；所述流加更换新的营养液的方法为：向已经排上清后的生物反应器中添加新鲜的营养液。

4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于，步骤3)中所述培养的条件为：温度为35℃-37.2℃，pH值为7.0-7.5，溶氧浓度为40％-60％，搅拌转速为80-120rpm；

优选温度为36.2℃-37.2℃，PH值为7.0-7.3，溶氧浓度为40％-60％，搅拌转速为80-120rpm。

5.根据权利要求2-4中任一项所述的方法，其特征在于，步骤4)中所述降温方式为：通过所述生物反应器的夹层冷冻水对步骤3)获得的复苏悬浮细胞液进行持续降温，并在降温同时逐步降低搅拌转速，直至搅拌转速为0rpm；其中所述夹层冷冻水温度为2-8℃。

6.一种利用生物反应器悬浮培养、保存和复苏BHK21细胞的连续生产方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1：在生物反应器中悬浮培养BHK21细胞至细胞密度为4.0×10⁶cell/ml及以上，活力90％以上；

S2：将步骤S1培养获得的BHK21细胞利用所述生物反应器进行降温并低温保存；

S3：经低温保存的BHK21细胞沉降后通过所述生物反应器进行排上清处理，再流加更换新的营养液；再次培养至细胞密度达到4.0×10⁶cell/ml及以上，活力90％以上，获得BHK21复苏细胞液；

S4：从所述生物反应器中排出步骤S3获得的BHK21复苏细胞液中的一部分用于生产，剩余部分补加新的营养液；

S5：重复步骤S1、步骤S2、步骤S3和步骤S4的操作M次，其中M为≥0的自然数。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤S1中所述悬浮培养BHK21细胞的条件为：温度为35℃-37.2℃，pH值为7.0-7.5，溶氧浓度为40％-60％，培养转速为80-120rpm，营养液为B21-JY培养基和2-5％血清；

优选地，所述悬浮培养BHK21细胞的条件为：初始细胞密度为0.4-1.0×10⁶cell/ml，温度为36.2℃-37.2℃，PH值为7.0-7.3，溶氧浓度为40％-60％，搅拌转速为80-120rpm，培养时间为48-72h，营养液为B21-JY培养基和2-5％血清。