[发明专利]一种提高发酵生产谷氨酰胺转胺酶产量的方法

说明书

本发明公开了一种提高发酵生产谷氨酰胺转胺酶产量的方法。该方法采用茂原轮枝链霉菌(Streptoverticillium mobaraense)DSM 40587为实验菌株，斜面孢子经种子培养后，接种至添加大豆多糖的发酵培养基中发酵制备谷氨酰胺转胺酶(MTG)，结果发现谷氨酰胺转胺酶的表达量显著提高。其中，添加6g/L的大豆多糖作用效果最佳。该方法的优点是使用的大豆多糖无毒无害，成本低廉，操作方便，能够提高工业生产谷氨酰胺转胺酶效率并降低经济成本。在相同实验条件下，大豆多糖的添加能使产酶时间提前27.6％及以上，显著缩短发酵时间。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，涉及一种提高发酵生产谷氨酰胺转胺酶产量的方法，具体涉及一种以大豆多糖为发酵添加剂实现茂原轮枝链霉菌谷氨酰胺转氨酶的高效率表达的方法。

背景技术

谷氨酰胺转胺酶(Transglutaminase,EC2.3.2.13简称TGase)广泛分布于各种生物体内，在生物体内起着重要的生理作用。TGase能够催化蛋白质中谷氨酰胺残基的γ-酰胺基和赖氨酸的ε-氨基之间进行酰胺基转移反应，形成ε-(γ-谷酰胺)-赖氨酸的异型肽键，能够促使蛋白质分子内交联，蛋白质分子间交联以及蛋白质和氨基酸之间的交联，被誉为“21世纪超级粘合剂”。因此在纺织、食品、生物、医药保健等方面具有广阔的应用前景。

目前TGase主要来源于微生物发酵，称为微生物TGase(MTG)。本发明中的茂原轮枝链霉菌的菌丝为一级或二级轮生，在液体中相互缠绕，不断聚集，最终形成紧密的球状。然而，很多情况下，菌丝球越大，营养物质，尤其是氧气，分散到菌丝球中间的能力越有限。通常，菌丝球中间的菌丝会因为营养受限发生自溶，即使是在对数生长期，菌丝球自溶也是存在的。无论对菌体代谢还是产物合成，这种自溶都是极其不利的。

发酵过程中菌丝体结球现象在另一种常见的丝状微生物真菌的液体培养中同样存在。但是1973年，Elmayergi等(Elmayergi H,Scharer JM,Moo-YoungM.Effects ofpolymer additives on fermentation parameters in a culture of A.niger[J].Biotechnology and Bioengineering.1973,15(5):845-859.)首次通过在生长培养基中加入高分子多聚阴离子率先克服了液体培养形成菌丝球这一问题。

由于丝状菌不同于单细胞细菌或酵母，其形态多样性使其生长情况更复杂，菌体的存在形态或形式对其液体发酵效率影响巨大。因此高分子多聚物对丝状菌分散培养的显著作用引起了广大学者的关注。Trinci等发现2g/L聚丙烯酸Junlon-110和Junlon-111能够与黑曲霉菌体减少孢子和菌丝的聚集，促进菌体分散；Byrne等观察到高分子聚合物，尤其是能与二价阳离子结合的阴离子聚合物，如Carbopol-934(聚羧乙烯)、Junlon(一种聚丙烯酸)或Hostacerin(聚丙烯酸钠)，能够提高发酵液黏度，促进少根霉菌菌丝分散，提高了菌丝球中央菌丝对营养的利用效率；而Jones等通过微粒微电泳技术证明了Junlon-110和Hostacerin能够与黑曲霉、黄孢原毛平革菌和地霉细胞壁结合，其游离羧基降低了菌体间静电，减少了孢子或菌丝聚合。

大豆多糖是由半乳糖(Gal)、阿拉伯糖(Ara)、半乳糖醛酸(GalA)、葡萄糖(Glc)、鼠李糖(Rha)、木糖(Xyl)和岩藻糖(Fuc)等构成的一种具有高度分支的水溶性多糖。与常用的水溶性多糖具有较高粘度不同，如常温下15％的大豆多糖的粘度范围为8.2～204cP(不同来源大豆水溶性多糖理化性质的研究，中国酿造，2016年第35卷第10期，31-35)，而1％的黄原胶的粘度则在2000cP以上。大豆多糖具有很好的溶解性、分散性，能够在水溶液中形成均匀的分散结构，且这种结构中高度分支，可以促使茂原轮枝链霉菌的菌丝分散，增加了传质能力，使分散到菌丝球中间的氧气含量增加，减少了和避免了菌丝球的自溶，增加了谷氨酰胺转胺酶的产量。

发明内容