[发明专利]一种用于体外转录mRNA的载体及其构建方法、利用载体转录得到mRNA的方法和应用

权利要求书

1.一种用于体外转录mRNA的载体，其特征在于，将5'UTR序列、目的基因序列、3'UTR序列和polyA序列顺次连接到载体中，得到用于体外转录mRNA的载体；

所述5'UTR序列的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；

所述3'UTR序列的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；

所述polyA序列的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。

2.权利要求1所述的用于体外转录mRNA的载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)采用XbalI和BamHI-HF酶切5'UTR质粒，得到5'UTR序列；

采用BamHI-HF和AscI酶切目的基因质粒，得到目的基因序列；

采用AscI和EcoRI-HF酶切3'UTR质粒，得到3'UTR序列；

采用EcoRI-HF和NotI-HF酶切polyA质粒，得到polyA序列；

采用XbalI和NotI酶对载体进行酶切，得到酶切载体；

2)将所述步骤1)得到的5'UTR序列、目的基因序列、3'UTR序列、polyA序列和酶切载体用T4连接酶连接，得到用于体外转录mRNA的载体。

3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述步骤2)连接的体系每10μl包括：浓度为200ng/μl的5'UTR序列溶液1.5μl、浓度为200ng/μl的3'UTR序列溶液1.5μl、浓度为200ng/ul的目的基因序列溶液1.5μl、浓度为200ng/μl的polyA序列溶液1.5μl、1μl T4连接酶、1μl 10×T4连接酶缓冲液和浓度为100ng/μl的酶切载体2μl；

所述连接的条件包括：37℃连接1h。

4.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述步骤1)

5'UTR质粒的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示；

所述3'UTR质粒的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示；

所述polyA质粒的核苷酸序列如SEQ ID No.8所示。

5.一种利用权利要求1所述的用于体外转录mRNA的载体转录得到mRNA的方法，其特征在于，包括以下步骤：

a、将权利要求1所述的用于体外转录mRNA的载体进行线性化处理，得到线性化载体；

b、将所述步骤a得到的线性化载体在37℃下金属浴4h，将得到的金属浴产物与DNA酶混合后在37℃下孵育15min，得到孵育物，将所述孵育物进行纯化，得到纯化物，将所述纯化物经去磷酸化酶在37℃下处理30min，得到处理物，将所述处理物纯化后，得到mRNA。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述金属浴的体系每40μl包括：浓度为1μg/μl的线性化载体溶液1μl、19μl Nuclease-free water、酶活为40U的RNase inhibitor 1μl、11μl NTP混合液、4μl 10×反应缓冲液、4μl 10×T7 RNA聚合酶混合物；

所述NTP混合液每11μl包括：浓度为75mM的ATP 4μl、浓度为75mM的GTP 1μl、浓度为100mM的Me-CTP 3μl和浓度为100mM的Pesudo-UTP3μl。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述线性化处理包括：将所述用于体外转录mRNA的载体进行PCR扩增，得到扩增产物，将所述扩增产物进行酶切，得到线性化载体；

所述PCR扩增使用的体系每20μl包括：10μl 2×Pfu PCR MasterMix、浓度为10μM的上游引物M13F 1μl、浓度为10μM的下游引物M13R 1μl、7μl超纯水和浓度为50ng/ul的用于体外转录mRNA的载体1μl；

所述PCR扩增的程序包括：94℃5min；94℃30s，57℃30s，72℃2min，30个循环；72℃10min。