[发明专利]一种纤维素外切酶基因及其蛋白和重组载体

说明书

本发明涉及一种茯苓的纤维素外切酶基因，还涉及含有该基因的重组载体及其表达重组蛋白的制备方法，该基因至少含有下列核苷酸序列之一的DNA片：1)序列表中SEQ ID NO.1的核苷酸序列；2)与SEQ ID NO.1所示核苷酸序列具有90％以上同源性、且编码相同生物学功能蛋白质的核苷酸序列。按照本发明所述的基因序列进一步构建组成型分泌表达载体并转化酵母，筛选的高水平分泌表达转化子能高水平分泌表达重组茯苓纤维素外切酶，通过镍亲和纯化，可得到纯度高于95％活性重组蛋白，该重组蛋白能将滤纸等纤维素类物质水解并产生葡萄糖的能力，在生物能源、饲料及食品行业等方面具有重要应用价值。

技术领域

本发明属于生物基因工程技术领域，涉及一种新的来源于茯苓的纤维素外切酶基因及其蛋白和重组载体。

背景技术

纤维素是自然界中最丰富的天然有机物，堪称为世界上总量最大的可再生资源。我国仅农作物秸秆年产量就高达6×10⁸～7×10⁸吨，但这些宝贵的纤维素资源并没有被有效地利用。利用微生物产生的纤维素酶来分解纤维素是一种高效且环保的方法。根据纤维素酶的结构不同，可把纤维素酶分为两类：纤维素酶复合体和非复合体纤维素酶。非复合体纤维素酶由内切糖苷水解酶、外切糖苷水解酶和β-葡聚糖苷酶组成。外切葡聚糖酶，可以随机切割纤维素链产生不同长度的寡糖和新的末端；外切葡聚糖酶，作用于外切葡聚糖酶切割形成的多糖链的末端，产生葡萄糖和纤维二糖；β-葡萄糖苷酶，水解纤维二糖生成2分子的葡萄糖。纤维素酶广泛存在于自然界的生物体中，如细菌、真菌、植物、动物等众多生物体都能产生纤维素酶。可以通过利用生物体产生的纤维素酶添加到纤维素原料中来利用这些原料，因此如何大量生产纤维素酶就成了制约纤维素利用的主要瓶颈。

纤维素是自然界中十分丰富的资源，但纤维素酶的工业化生产受到酶效率低、热稳定性差以及成本较高等诸多因素的限制。随着生物技术的发展，利用基因工程手段开发高活性、高产量的纤维素酶资源越来越受到国内外学者的重视。目前，纤维素酶基因的克隆及表达已经取得了很大的进展，但是还有很大的空间值得人们去研究，开发出越来越多的高活性、高产量的纤维素酶。由于市售纤维素酶往往是众多酶的混合物，很难买到完全由纤维素酶类组成的酶制剂，因此利用基因工程手段逐一生产构成纤维素酶的单体酶成分，再将它们按适当比例混合，是生产纯纤维素酶的可行途径之一。

大肠杆菌的遗传背景清楚，又由于其具有周期短、高效率、易操作、使用安全等特点，成为外源基因的首选表达系统。不少研究者将昆虫神经毒素构建大肠杆菌表达载体，经转化E.coli在BL21(DE3)进行表达，但得到的都是无活性的包涵体，通过体外合适的条件下溶解、变性、复性、纯化，从每升培养基可得到仅能得到几十至上百微克的的可溶性蛋白质。在大肠杆菌中表达，可能因为LPS的存在而产生毒性，因此往往需要对表达纯化产物的毒性进行分析测定。最后，要得到高纯度的蛋白往往需要经过多步纯化操作处理，纯化的步骤越多，蛋白质的得率就会越低，且更可能导致目标产物的失活。在申请号为CN201811238622.2中，以pET32为表达载体利用BL21为表达菌株对纤维素外切酶进行了表达并纯化得到一定量活性好的重组蛋白，但利用上述载体表达的蛋白都是胞内蛋白，纯化时需要先破碎菌体，纯化步骤比较麻烦且回收率较低。酵母是一种高效的外源基因表达体系，以Pichiapastoris(毕赤巴斯德酵母)为宿主的外源基因表达系统近年来发展最为迅速，应用也最为广泛。但每一种蛋白能否实现在酵母中的高水平分泌表达需要合适的基因序列、筛选高水平分泌表达的转化子、优化表达条件和建立高效的蛋白纯化方法。

发明内容

针对现有技术中的缺陷，本发明目的在于提供一种新的来源于茯苓的纤维素外切酶基因及其蛋白和重组载体。还提供了纤维素外切酶蛋白的高表达制备方法。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

1、本发明提供一种基因，为编码纤维素外切酶类蛋白的基因，为如下(1)-(3)中任意一种的DNA分子：

(1)由序列表中SEQ ID No.1所示的DNA分子；