[发明专利]一种快速有效的鉴定活体斑马鱼胚胎基因型的方法

权利要求书

1.一种快速有效的鉴定活体斑马鱼胚胎基因型的方法，其特征在于将单个活体斑马鱼胚胎放至一种含蛋白酶的DNA收集液中后，转移至适当的温度条件且在一定转速的摇动或震动的情况下孵育一段时间，然后收取DNA收集液，同时在单个胚胎中加入胚胎恢复液。收集到的DNA收集液中含有从活体胚胎中分离出的含核上皮细胞，经加入裂解液处理后可直接用作基因组DNA模板用于未来的基因型鉴定，加入胚胎恢复液的斑马鱼胚胎可正常发育与生长。

2.如权利要求1所述的方法，其中，所述的动物除斑马鱼外，还可以是青鳉鱼、黄颡鱼、鲤鱼、石斑鱼、和爪蛙等其它胚胎体外发育的水生动物。所述的胚胎时期可以是从受精卵到受精后120hpf(受精后小时数)，优选的发育时期为24至96hpf。

3.如权利要求1所述的方法，其中，所述的蛋白酶包括胰蛋白酶、蛋白酶(Pronase)、I型胶原蛋白酶(Collagenase Type I)和蛋白酶K(Pronase K)。优选所述的蛋白酶是蛋白酶K。

4.如权利要求1所述的方法，其中配制DNA收集液的DNA收集缓冲液为磷酸盐缓冲液(PBS)、鱼用生理盐水(0.68％氯化钠)、Tris溶液或E3培养液以及在任一种溶液中同时加入三卡因溶液。优选所述的DNA收集缓冲液为Tris溶液加三卡因溶液。其中三卡因仅用作麻醉剂麻醉动物胚胎，浓度为20至200mg/L，优选160mg/L。

5.如权利要求4所述，其中所述的Tris溶液的浓度为1mM至100mM，优选浓度为30mMTris。所述的Tris溶液的pH值为6.5至8.5，优选的pH值为pH8.0。

6.如权利1要求所述，其中所述的温度条件指是活体胚胎在DNA收集液中孵育的环境温度为23℃至42℃，其中所述的优选环境温度为37℃，一般可选择隔水式恒温培养箱提供。

7.如权利要求1所述，其中所述的转速为50至1,000转/秒(rpm)，优选为500rpm。

8.如权利要求1所述，其中所述的孵育时间为5至60min。其中不同发育时期胚胎优选的孵育时间不同。具体地：24hpf胚胎的优选孵育时间为15min；48hpf胚胎的优选胚胎孵育时间为20min；72hpf胚胎的优选孵育时间为30min；96hpf胚胎的优选孵育时间为30min。

9.如权利要求1所述，其中所述的胚胎恢复液配方为含0.00％至0.68％NaCl、0.00％至0.68％KCl、0.00％至0.68％CaCl₂.2H₂O、和0.00％至0.68％MgSO₄7H₂O，pH为6.5至8.5。其中所述的优选配伍为每升溶液含294mg NaCl、513mg KCl、49mg CaCl₂.2H₂O、和81mgMgSO₄.7H₂O；其中优选的pH为7.2。

10.如权利要求1所述，其中的用作鉴定基因型的基因组DNA模板制备方法为将其中10％至75％的DNA收集液取出后加入0.1至1体积裂解液(优选的含10mM Tris-HCl(pH8.0)、50mM KCl、0.3％Tween 20、0.3％NP40和1mM EDTA)在90-100℃条件下孵育1-15分钟以灭活蛋白酶K，其中的优选的方法是在30μl收集的DNA收集液中加入15μl的裂解液后，在98℃条件下孵育5分钟以灭活蛋白酶K且释放出基因组DNA，最后用作基因组DNA模板以进行基因型鉴定。