[发明专利]一种从浓香型大曲中分离纯化酯化酶的方法

说明书

本发明公开了一种从浓香型大曲中分离纯化酯化酶的方法，以浓香型大曲为试验材料，用DEAE纤维素DE‑52离子交换层析和葡聚糖G‑100凝胶层析相结合的方法对大曲中的酯化酶进行了分离纯化。本发明产物通过SDS‑PAGE检验其纯度时显示为两条主要的条带，分子量分别为37.2kD和30.8kD，经过四步纯化后，酯化酶被纯化了3.49倍，酶活回收率为28.01％。

技术领域

本发明属于酯化酶技术领域，具体涉及一种从浓香型大曲中分离纯化酯化酶的方法。

背景技术

大曲是以小麦、大麦和豌豆等为主要原料经破碎、加水搅拌、经人工踩制或机械压制成砖块状的曲坯后，在一定温度、湿度下培养而成的糖化发酵剂。由于在制曲过程中网罗了自然环境中的大量有益微生物，经过发酵培菌管理，使成品大曲中含有丰富的酿酒微生物菌系、酶系和物系。大曲具备糖化、发酵、酒化和生香的功能，为白酒发酵提供内在动力，有“大曲是酒之骨”的说法。

大曲中含有丰富的酶类，按照作用规律可分为：淀粉酶、蛋白酶、酒化酶、酯化酶、纤维素酶、木聚糖酶等酶类。酯化酶作为大曲中一种重要的酶类，在白酒发酵后期生香过程中发挥着关键作用。酯化酶不是酶学上的术语，白酒生产中是指脂肪酶、酯酶、磷酸酯酶的统称。该酶既能催化酯的合成，也能催化酯的分解。因此，白酒业习惯分别称为酯化酶和酯分解酶。

酶分离纯化的常规方法是用硫酸铵沉淀，有机溶剂沉淀，离心(或过滤)，超滤等方法对酶粗分，再结合层析(离子交换、凝胶过滤、疏水层析和亲和层析等)，电泳等方法实现对酶的精分。随着生物产业下游技术的发展，一批新的分离纯化技术如膜处理技术，免疫纯化技术，双水相体系萃取，界面亲和层析技术，反微团萃取，超临界流体萃取，高效液相层析和高效液相亲和层析技术，大规模电泳技术，逆流色谱及置换色谱技术等也开始应用。

目前酯化酶技术应用于浓香型白酒增香方面已取得了良好的效果，使用比较多的是外加酯化酶增香法，而关于对大曲中本身存在的酯化酶的研究报道还比较少。当前的研究主要集中在对红曲霉、根霉和生香酵母的分离筛选，产酶(生酯)条件的优化，酶学性质的研究及应用上。

发明内容

本发明的目的在于：提供一种从浓香型大曲中分离纯化酯化酶的方法，直接从大曲中分离纯化酯化酶，初步探索其中酯化酶的组成种类及分子量，为进一步研究其酶学性质提供基础，并为浓香型白酒酿造过程中酯化酶的应用提供理论依据。

本发明采用的技术方案如下：

一种从浓香型大曲中分离纯化酯化酶的方法，包括以下步骤：

S1.将浓香型大曲粉碎，然后过40目筛，得到大曲粉；

S2.将步骤S1所得大曲粉置于浓度为0.2-0.4mol/L、pH6的NaCl溶液中，于3-5℃温度下浸泡1-2h，过滤得到滤液；

S3.将步骤S2所得滤液在3-5℃搅拌，加入硫酸铵，使溶液饱和度达到25-35％，搅拌15-30min，置于3-5℃温度下沉淀1.5-2.5h后，冷冻离心13-15min，取上清液，再加入硫酸铵使溶液饱和度达到75-85％，搅拌待硫酸铵全部溶解后再搅拌15min，搅拌15-30min，置于3-5℃温度下沉淀1.5-2.5h后，冷冻离心16-25min，取沉淀加入pH＝8.5的Tris-HCl缓冲液复溶，再于3-5℃下离心去除沉淀，得到粗酶液A；

S4.将步骤S3所得粗酶液A在3-5℃搅拌，加入体积为粗酶液A3-4倍的-20℃预冷的丙酮，于-20℃放置过夜，然后冷冻离心13-15min，弃上清液，对沉淀清洗除杂后，用pH＝8.5的Tris-HCl缓冲液复溶，再于3-5℃下离心去除沉淀，得到粗酶液B；

S5.用0.02mol/L、pH＝8.5 Tris-HCl缓冲液平衡DEAE纤维素DE-52离子交换层析柱，将步骤S4所得粗酶液B经0.45μm微孔滤膜过滤后进行梯度洗脱，得浓缩液；