[发明专利]可溶性Tim-3重组蛋白及其突变型蛋白的制备和应用

说明书

本发明属于生物技术领域，具体内容涉及可溶性Tim‑3重组蛋白及其突变型蛋白的制备和应用。可溶性Tim‑3重组蛋白用于制备具有调控单核细胞功能的药物或增强肿瘤免疫应答的功能的药物中的应用，所述可溶性Tim‑3重组蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:1。另外，本发明还提供了可溶性Tim‑3重组蛋白的突变型蛋白，及其突变型蛋白和突变型蛋白的制备和应用。所述突变型重组蛋白是通过定向进化技术筛选获得，具有调控单核细胞功能或增强机体免疫应答功能，并结合宿主密码子优化方式，提高其表达效率。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体内容涉及可溶性Tim-3重组蛋白及其突变型蛋白的制备和应用。

技术背景

生物技术药物主要包括蛋白质、多肽和核酸分子，几乎覆盖了包括癌症、自身免疫性疾病以及传染病等的上百种疾病。应用蛋白质工程技术制造的重组蛋白类产品在人们的生产、生活、医疗中发挥着不可或缺的作用。重组蛋白质药物是目前最主要的一类生物技术药物，与小分子化学药物相比，具有疗效好、副作用小和生物功能明确等一系列优点。

肝衰竭是多种因素引起的严重肝脏损害，出现以凝血机制障碍和黄疸、肝性脑病、腹水等为主要表现的一组临床症候群。发病急骤，病死率高，危害极大。它是全球公认的危及患者生命的、极具挑战性的临床危重症，目前尚缺乏特效药物和手段。目前认为肝移植是治疗本病的最有效手段，但由于供肝短缺及治疗费用高昂，其临床运用受到极大限制。固有免疫细胞单核细胞过度活化在肝衰竭发病机制中起到重要作用。细胞表面的Tim-3(T cellimmunoglobulin-and mucin-domain-containing molecule-3)在单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞和淋巴细胞等均有表达，单核细胞膜上Tim-3分子脱落产生的可溶性Tim-3(soluble Tim-3,sTim-3)，与败血症患者的IL-12和TNF-α表达成负相关，课题组前期体外研究发现，sTim-3可使LPS刺激的原代人单核细胞TNF-α表达水平下降，表明sTim-3具有抑制单核细胞活化作用。

目前，每年肝癌患者占到全世界新发现恶性肿瘤病人的4％，肝癌已成为国内肿瘤死亡病因的第二位，有极高的发病率和致死率。现以形成以手术切除为主的治疗方式，然而手术治疗预后差，易复发。研究表明，长期的免疫力低下也是癌症产生的重要原因之一，提高机体的免疫水平是肿瘤治疗的关键手段。因此寻找具有提高免疫力水平作用的抗癌药物是非常必要的。肿瘤免疫治疗是许多治疗方法的总称，有免疫检查点(check point)疗法、细胞因子疗法、肿瘤疫苗和细胞治疗。肿瘤免疫检查点分子的研究主要集中在Tim-3、CTLA-4、PD1三个分子上，这些分子抑制微环境中免疫细胞活性，肿瘤免疫检查点抑制剂是目前肿瘤免疫治疗的最主要方面，通过抑制肿瘤细胞的免疫逃逸，调动自身免疫系统功能消除肿瘤。Tim-3分子的发现是源于寻找区分Thl细胞和Th2细胞的表面标志物。最近研究发现，通过使用半定量RT-PCR方法，测定荷瘤小鼠不同时间段的可溶性Tim-3和CTLA-4等指标的表达水平，同时测定肿瘤生长。结果发现，肿瘤生长与CTLA-4表达成正相关，与可溶性Tim-3负相关，提示可溶性Tim-3可能具有抑制肿瘤生长作用，目前未有研究报道可溶性Tim-3在肝癌中的作用。最近对HIV疫苗的细胞介导免疫应答的研究表明，可溶性PD1和可溶性Tim-3增强腺病毒载体SIV疫苗(rAd5-SIV)对小鼠T细胞增殖能力，产生更多的抗原特异IFN-γ(+)CD4(+)和CD8(+)T细胞。提示sTim-3可能具有免疫佐剂作用，增强机体的T细胞免疫应答。

发明内容

本发明提供了一种新型的可溶性Tim-3重组蛋白的应用及其纯化方法。

可溶性Tim-3重组蛋白用于制备具有调控单核细胞功能的药物或增强肿瘤免疫应答的功能的药物中的应用，所述可溶性Tim-3重组蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:1(所述可溶性Tim-3重组蛋白包含或不包含组氨酸标签序列如HHHHHH；如果包含组氨酸标签序列时如HHHHHH，在标签序列前加上连接肽如(G)nS，n＝1到4，优选的n为4)。