[发明专利]检测猪基因组脱靶整合风险的方法

权利要求书

1.一种检测猪基因组脱靶整合风险的方法，其特征在于：包含如下步骤：

1)目标基因在猪基因组内源基因座定位整合检测：

PCR法检测绿色荧光蛋白基因在猪肌肉生长抑制素基因外显子3座位上定位整合；细胞基因组DNA提取200uL培养细胞离心收集细胞沉淀，加200uLPBS悬浮细胞；使用PCR摸板制备试剂盒提取细胞基因组总DNA，加30uLddH₂O溶解收集DNA样品；

2)分子定位PCR检测GFP基因引物筛选：根据CRISPR/Cas9打靶载体HRX-2MCS制定的打靶位点，在猪MSTN外显子区和GFP基因区设计引物，检测GFP基因在猪MSTN基因外显子上的定位整合情况；经过多次扩增测试所得到的检测引物序列，筛选GFP、MSTN序列PCR引物，如下所示：

(1)QF1正向引物，其序列如SEQ ID NO.1所示；

(2)T3-up正向引物，其序列如SEQ ID NO.2所示；

(3)T3-down反向引物，其序列如SEQ ID NO.3所示；

(4)MKR反向引物，其序列如SEQ ID NO.4所示；

T3位点GFP基因定位整合检测MSTN基因T3整合位点GFP全长表达框基因5’端定位检测引物为T3-up、MKR，扩增片段长度750bp，PCR反应条件：94℃2min；94℃40s，59℃30s，72℃1min，30次循环反应；72℃延伸5min；GFP基因3’端定位检测引物QF1、T3-down扩增片段长度为1.5Kb，PCR反应条件：94℃2min；94℃40s，58℃30s，72℃1min，30次循环反应；72℃延伸5min；GFP全长基因定位检测引物为T3-up、T3-down扩增片段长度为4.8Kb，PCR反应条件：94℃2min；94℃50s，58℃45s，72℃5min，30次循环反应；72℃延伸5min；

GFP基因PCR检测反应体系每株细胞DNA样品取6uL/80ng，加入10xLATaqbuffer5uL、有Mg2+；Taq酶5U/uL、0.5uL；4xdNTPs、每种2.5mmol/L、8uL；1uL引物P1、10umol/L；1uL引物P2、10umol/L；加ddH2O至总体积50uL；用1％琼脂糖凝胶电泳检查扩增带情况；

T3位点GFP基因定位整合检测培养细胞经过分子定位PCR检测，有3株细胞GFP基因在猪MSTN基因外显子3上T3位点整合；GFP全长表达框基因5’端定位PCR检测特异扩增片段长度为750bp；GFP基因3’端定位PCR检测特异扩增片段长度为1.5Kb；GFP全长基因定位PCR扩增特异扩增片段长度为4.8Kb，检测，9号阳性细胞GFP全长基因扩增得到4.8Kb和1.7Kb两条扩增带，表明这个细胞株GFP基因在MSTN等位基因T3位点上只整合一个基因位置；

3)改进的Q-PCR法检测GFP基因整合拷贝数：

外源基因拷贝数测定中GFP基因正对照质粒长8kb，将质粒DNA浓度稀释到0.3pg/uL；每次实验设置4个正对照样品，分别取正对照质粒0.4、0.8、1.2、1.6uL，相当于在90ng猪基因组DNA样品中1个双倍体基因组整合GFP外源基因的拷贝数分别是1.0、2.0、3.0、4.0个拷贝；测试样品及阴性对照样品取90ngDNA，两个β-actin内参基因样品取60～150ngDNA；GFP基因扩增产物长度是120bp，引物序列为：

(1)HMGP1正向引物，其序列如SEQ ID NO.5所示；

(2)HMGP2反向引物，其序列如SEQ ID NO.6所示；

β-actin基因扩增片段长度是500bp，其引物序列为：

(3)ACP1正向引物，其序列如SEQ ID NO.7所示；

(4)ACP2正向引物，其序列如SEQ ID NO.8所示；

PCR反应体系：2×Faststartuniversal SYBR Green Master反应混合液12.5uL，

10umol/L引物HMGP11uL，

10umol/L引物HMGP11uL，

或者10umol/L引物ACP11uL，

10umol/L引物ACP21uL，

DNA样品0.6～2.4ul，

加ddH2O至总体积25uL；

PCR反应条件：94℃下2min；94℃下30s，55.5℃下35s，72℃下30s，35～40次循环反应；熔解曲线反应条件：95℃，15s；60℃，1min；95℃，15s；60℃，15s；

观察并记录实验样品Ct值，检查熔解曲线峰值；内参照基因扩增曲线正常，样品熔解曲线峰值单一，实验样品Ct值为检测有效值；比较Ct值大小，计算测试样品GFP基因的拷贝数，检测实验重复三次。