[发明专利]一种抗虫低酚棉花品种的育种方法

权利要求书

1.一种抗虫低酚棉花品种的育种方法，利用RNAi技术沉默转Bt基因抗虫棉中的杜松烯合成酶基因CAD1-A，制得复合转基因棉花品种，具体步骤包括：

S1、对所述CAD1-A基因进行克隆，得CAD1-A-1质粒；

S2、构建CAD1-A基因的RNAi表达载体；

S3、采用根癌农杆菌介导法对所述转Bt基因抗虫棉的胚性愈伤组织进行遗传转化；

其中，所述步骤S2中RNAi表达载体中CAD1-A基因由α-球蛋白启动子驱动，所述α-球蛋白启动子用EnhⅠ增强子进行修饰。

2.根据权利要求1所述的育种方法，其特征在于：利用所述α-球蛋白启动子+GUS报告基因的植物双元表达载体构建所述CAD1-A基因的RNAi表达载体。

3.根据权利要求2所述的育种方法，其特征在于：所述步骤S2的构建方法为：

1）使所述α-球蛋白启动子+GUS报告基因的植物双元表达载体的部分GUS缺失，得空白RNAi表达载体；

2）向1）中所得载体插入CAD1-A基因正向序列，得CAD1-A-R的RNAi表达载体；

3）向2）中所得载体插入CAD1-A基因反向序列，得CAD1-A基因的RNAi表达载体。

4.根据权利要求3所述的育种方法，其特征在于：所述步骤1）中空白RNAi表达载体的制备方法，包含：

a、对所述GUS基因的内含子Intron1进行PCR扩增，回收纯化，得目的片段Ⅰ；

b、使用SacI对所述植物双元表达载体进行酶切，回收纯化，得目的片段Ⅱ；

c、使用XhoI对目的片段Ⅱ进行酶切，回收纯化，得目的片段Ⅲ；

d、将目的片段Ⅰ和目的片段Ⅲ进行连接，得空白RNAi表达载体。

5.根据权利要求3所述的育种方法，其特征在于：所述CAD1-A基因正向序列的制备方法为：以SEQ ID NO.1，SEQ ID NO.2为引物对所述步骤S1中CAD1-A-1质粒进行PCR扩增，所得PCR产物即为CAD1-A基因正向序列。

6.根据权利要求3所述的育种方法，其特征在于：所述CAD1-A基因反向序列的制备方法为：以SEQ ID NO.3，SEQ ID NO.4为引物对所述步骤S1中CAD1-A-1质粒进行PCR扩增，所得PCR产物即为CAD1-A基因反向序列。

7.根据权利要求1所述的育种方法，其特征在于：所述胚性愈伤组织进行遗传转化前预培养14-16d。

8.根据权利要求1所述的育种方法，其特征在于：所述CAD1-A基因的RNAi表达载体通过电击转化或者热激法转入到所述根癌农杆菌中。

9.根据权利要求1所述的育种方法，其特征在于：所述步骤S3中进行遗传转化的具体步骤，包含：

1）根癌农杆菌的转化、菌液活化及侵染：将胚性愈伤组织接入容器中，加入活化后的根癌农杆菌菌液，侵染12-15min，期间不断振荡，弃去菌液，用无菌水重复清洗胚性愈伤组织，吸干，转入含有熊果酸邻苯二甲酸单酯二钠盐和环糊精葡萄糖衍生物的共培培养基上21-23℃暗培养22-26h；

2）筛选培养，分化培养，生根培养，练苗。

10.权利要求1-9任一项中所述的育种方法在培育集粮、棉、油三位一体的棉花品种中的用途。