[发明专利]基于非天然核酸纳米镊子的特异性检测技术在活细胞mRNA检测中的检测方法及其应用

权利要求书

1.基于非天然核酸纳米镊子的特异性检测技术在活细胞mRNA检测中的检测方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)设计并合成非天然核酸纳米镊子；

(2)使用纳米镊子对活细胞内目标mRNA进行检测；

(3)进行荧光光谱分析。

2.根据权利要求1所述的基于非天然核酸纳米镊子的特异性检测技术在活细胞mRNA检测中的检测方法，其特征在于：在步骤(1)中，所述的不同非天然核酸纳米镊子的构建，设计三条非天然核酸单链：中心链的两端采用两种可发生能量共振转移的荧光基团进行标记，另外两条单链分别延伸出几个碱基序列，用于与目标的mRNA进行碱基互补配对；可以针对不同的检测环境要求，改变非天然核酸的化学种类来实现。

3.根据权利要求2所述的基于非天然核酸纳米镊子的特异性检测技术在活细胞mRNA检测中的检测方法，其特征在于：在步骤(1)中，

Step1：将两条甲氧基修饰的非天然核酸单链,以及一条荧光基团修饰的单链分别以1：1：1的摩尔比混合，加入10μL 10×TAE-Mg²⁺缓冲液，所述的缓冲液中Mg²⁺浓度为12.5mol/L，补超纯水至最终体积100μL，震荡均匀，具体体积可根据需要组装，最终TAE-Mg²⁺缓冲液为1X即可；

Step2：将混合溶液置于PCR仪中，以0.1℃/10s的速率从95℃～20℃退火，组装成1μM的甲氧基修饰的纳米镊子结构，4℃放置待用。

4.根据权利要求1所述的基于非天然核酸纳米镊子的特异性检测技术在活细胞mRNA检测中的检测方法，其特征在于：在步骤(2)中，所述的对目标mRNA进行检测，当体系中存在目标mRNA时，纳米镊子由原来的打开状态变成关闭状态；当体系中不存在完全互补配对的mRNA分子时，纳米镊子结构将不会发生变化，从而保证检测的高特异性。

5.根据权利要求1所述的基于非天然核酸纳米镊子的特异性检测技术在活细胞mRNA检测中的检测方法，其特征在于：在步骤(2)中，Step1：将在96孔板中培养的活细胞用PBS缓冲液清洗三次，然后加入20μL组装形成的甲氧基修饰的纳米镊子以及180μL的培养液(10％血清+89％高糖培养液+1％抗体)，在37℃、5％CO₂的条件下共孵育3小时，使其进入细胞并与目标mRNA结合；

Step2：在此体系内以纳米镊子：燃料链为1：1的摩尔比加入燃料链，在37℃、5％CO₂的条件下共孵育3小时，使其进入细胞并与目标mRNA结合，将目标mRNA从纳米镊子上置换下来，使纳米镊子回到初始打开状态，用于下一轮检测。

6.根据权利要求1所述的基于非天然核酸纳米镊子的特异性检测技术在活细胞mRNA检测中的检测方法，其特征在于：在步骤(3)中，所述的荧光光谱分析，当纳米镊子由原来的打开状态变成关闭状态，所携带的两种荧光基团相互靠近，荧光能量共振转移增加，通过这一光学信号的变化来达到检测的目的。

7.根据权利要求6所述的基于非天然核酸纳米镊子的特异性检测技术在活细胞mRNA检测中的检测方法，其特征在于：在步骤(3)中，将甲氧基修饰的纳米镊子，纳米镊子与活细胞共孵育后的产物，以及加入燃料单链孵育后的产物，置于酶标仪下进行检测，设置激发波长为513nm，并用活细胞加培养液作为调零组，重复三次实验，取平均值；当细胞中存在目标mRNA时，该体系将可观察到荧光共振转移现象，加入燃料链后，荧光共振转移现象消失，证明纳米镊子可回复初始打开状态。

8.权利要求1所述的甲氧基修饰的非天然核酸纳米镊子在监测糖尿病中的应用。

9.权利要求1-8任一项所述的基于非天然核酸纳米镊子的特异性检测技术及其在活细胞mRNA检测方面的应用。

10.根据权利要求9所述的基于非天然核酸纳米镊子的特异性检测技术及其在活细胞mRNA检测方面的应用，其特征在于：能够根据需要，实时动态监测不同的目标mRNA的变化；还能通过在组装的非天然核酸单链上进行化学修饰，使其具有特定的性能，适应细胞内检测；其检测步骤如下：

(1)将非天然核酸纳米镊子与待检测细胞共培养，前者将进入细胞内与目标mRNA结合；

(2)非天然纳米镊子与目标mRNA的结合将前者从打开状态变为关闭状态，引发荧光能量共振转移；

(3)在荧光检测平台观察细胞反应前后的荧光变化。