[发明专利]苜蓿中华根瘤菌的氧还蛋白及其应用

说明书

本发明涉及一种苜蓿中华根瘤菌的氧还蛋白及其应用。该基因为SEQ ID NO：1所示的碱基序列，其编码的蛋白即为LsrB蛋白。本发明首次在中华苜蓿根瘤菌中鉴定到一种新型的氧还蛋白编码基因lsrB，通过在氧还状态异常的根瘤菌中表达lsrB基因证明了该基因及其编码的氧还蛋白具有抗氧化，解氧化物毒性的功能。本发明首次利用新型氧还蛋白LsrB的编码基因lsrB和绿色荧光蛋白eGFP编码基因（该基因为SEQ ID NO:2所示的碱基序列）构建了表达载体pSRK‑lsrB‑eGFP作为一种氧还探针，能够通过荧光信号的强弱实时监测细胞的氧化状态。

技术领域

本发明涉及一种苜蓿中华根瘤菌（Sinorhizobium meliloti）的新型氧还蛋白及其在解氧化物毒性、检测细胞氧化状态方面的应用。

背景技术

大多数陆生植物与真菌或细菌建立共生关系，为它们的生长提供营养。氮和磷是植物生长和生产力的关键决定因素。在植物界中，豆科植物能与根瘤菌科土壤细菌形成固氮共生体系，将大气中的气态氮（N2）还原为氨态氮（NH4⁺）。具有固氮能力的细菌仅限于产生固氮酶的细菌和古细菌。豆科植物大多是重要的经济作物，一方面对动物和人类营养的贡献，另一方面通过参与土壤的氮富集，从而减少氮肥的使用，为其在农业种植中的生态系统服务。因此，对这些共生体的研究是促进更环保农业的一大挑战。

根瘤菌和豆科植物之间的固氮共生（NFS）形成了植物根的新器官，称为根瘤。根瘤的发育需要许多关键步骤来实现成熟的有效固氮根瘤。在细菌分化为固氮类菌体的过程中，参与细胞氧化还原状态调节的细胞的抗氧化成分也参与根瘤的发育。但是随着根瘤菌侵染过程的进行，植物-病原菌的非亲和反应中就能检测到大量的ROS积累，成为“氧爆”。氧爆导致的共生体系中氧化还原平衡的变化一方面调节着共生互作的生理过程，一方面威胁着细菌的正常生存。当细菌内的抗氧化剂不足以代谢ROS时，便形成了氧化胁迫（Oxidativestress）。氧化胁迫会导致蛋白质、细胞膜脂质过氧化以及DNA损伤，例如OH^-攻击DNA时会引起DNA链的断裂，一些脂质氧化物也会直接或间接地造成DNA损伤。除此之外，许多药品以及化学药物亦可直接或间接诱导细胞内产生ROS。

为了应对植物产生的大量活性氧，细菌在进化过程中形成了一套抵抗氧化损伤作用的防伪系统来保证自身存活和共生侵染过程的正常进行。它们包括抗氧化酶如：超氧化物歧化酶、过氧化物酶、过氧化氢酶和小分子抗氧化剂如谷胱甘肽（GSH）以及氧还蛋白如谷氧还蛋白、硫氧还蛋白。今年来发现了一种蛋白LsrB，它是从LysR转录因子家族进化的一种新型的氧还蛋白，由303个氨基酸组成，前116个氨基酸编码了其DNA结合结构域，后187个氨基酸编码了其底物结合结构域，前期研究表明该底物结合结构域具有氧还蛋白的功能，对细菌的抗氧化及共生固氮不可或缺。已有研究表明该氧还蛋白通过其半胱氨酸位点形成二硫键来降低细胞的氧化水平，同时该蛋白通过结合自身启动子调节自身基因表达量，在细胞氧化压升高时增加lsrB表达量，进而降低细胞氧化水平。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种苜蓿中华根瘤菌的氧还蛋白LsrB。

本发明的目的之二在于提供一种含有该氧还蛋白编码基因的表达载体。

本发明的目的之三在于提供该蛋白在解氧化物毒性方面的应用。

本发明的目的之四在于提供一种含有绿色荧光蛋白编码基因的融合蛋白表达载体。

本发明的目的之五在于提供该载体在检测细胞氧化状态过程中，作为荧光探针实时监控细胞所面临的氧化压中的应用。

为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：