[发明专利]一种确定产氢产乙酸菌最适保存温度的方法

说明书

本发明公开了一种确定产氢产乙酸菌最适保存温度的方法，属于环境工程技术领域。本发明通过流式细胞术对产氢产乙酸菌中活细胞，凋亡早期细胞，凋亡晚期细胞和死细胞比例进行表征，并与产氢产乙酸菌活性恢复过程的特征指标进行关联性分析，建立了基于流式细胞术的确定产氢产乙酸菌最适保存温度的方法。运用此方法，可以省略产氢产乙酸菌活性恢复的步骤，有效帮助准备采用产氢产乙酸菌强化底物转化的高浓度有机废处理工程，并显著提升产氢产乙酸的生产效率，其中产氢气和乙酸产量均超过18.0％和620mg/L，且能够维持长期稳定运行，具有很高的可行性。

技术领域

本发明涉及一种确定产氢产乙酸菌最适保存温度的方法，属于环境工程技术领域。

背景技术

随着高浓度有机废水厌氧生物处理技术的成熟，提高有机废水的资源化利用效率，最大限度生产资源化气体甲烷，减少二氧化碳等温室气体的排放成为国家战略需要。厌氧处理过程的关键微生物主要为产酸发酵菌群，产氢产乙酸菌群以及产甲烷菌群，其中产氢产乙酸菌群在营养生态位上位于产酸发酵菌群和产甲烷菌群之间，在功能生态位上发挥承上启下的作用，它将产酸发酵菌群代谢产生的丙酸、丁酸等有机挥发酸进一步降解转化为乙酸、CO₂和H₂，为后续的产甲烷菌群提供了可以直接利用的底物，是有机物甲烷发酵过程必不可少的重要环节。因此，强化产氢产乙酸菌群的功能作用，将有效地提高厌氧生物处理系统的效能。但是参与厌氧生物处理的各主要微生物类群在生理生化特性上差异悬殊，且产氢产乙酸细菌是一类严格厌氧细菌，生长周期长，且大部分产氢产乙酸细菌都是互营细菌，较难获得具有产氢产乙酸的纯培养菌，如果可以将分离得到的具有降解挥发性有机酸的产氢产乙酸菌培养成熟并予以保存，则可以有效促进高浓度有机废水的底物转化率，显著提升高浓度废水中的甲烷生产效率。温度是影响微生物活性最重要的参数，确定最适于产氢产乙酸菌的保存温度，有助于简化产氢产乙酸菌的活性恢复过程，缩短基于高浓度有机废水的高效甲烷产生时间。然而，菌群同时受到环境中多种因素的干扰，比如pH等，需求一种不受其他因素干扰，准备指示温度的方法是有非常重要的应用意义的。现有方法对于最适保存温度的确定需要将产氢产乙酸菌重新接种于厌氧生物反应器中，约需30d以上才能确定产氢产乙酸菌活性恢复的效果，成为制约基于产氢产乙酸菌强化产甲烷技术的工程化应用关键所在。

发明内容

技术问题：现有方法对于最适保存温度的确定需要将产氢产乙酸菌重新接种于厌氧生物反应器中，约需30d以上才能确定产氢产乙酸菌活性恢复的效果，成为制约基于产氢产乙酸菌强化产甲烷技术的工程化应用关键所在。

本发明技术方案：

本发明的第一个目的是提供一种确定产氢产乙酸菌的最适保存温度的方法，所述方法是利用流式细胞术测定不同温度保存的产氢产乙酸菌的细胞活性状态，将其中细胞活性状态最接近厌氧颗粒污泥中试运行时的细胞活性状态时保存的温度确定为最适保存温度；所述利用流式细胞术测定细胞活性状态的方法包括如下步骤：

(1)产氢产乙酸菌测试样液的制备：用缓冲液稀释产氢产乙酸菌样品，并加入半胱氨酸，混合均匀后过滤，取沉淀物；再用缓冲液稀释，同时加入半胱氨酸混合均匀；过滤取沉淀物，使用添加了半胱氨酸的预冷缓冲液吹洗细胞，重复离心和清洗，再取上清液作为样品，使用适量10x Annexin V Binding Buffer混匀制得；

(2)置于流式细胞仪测定各样液的细胞活性状态。

在本发明的一种实施方式中，半胱氨酸相对缓冲液的添加量不低于0.8-2.0mg/mL。

在本发明的一种实施方式中，预冷缓冲液中半胱氨酸的浓度为0.8-2.0mg/mL。

在本发明的一种实施方式中，所述产氢产乙酸菌的细胞活性状态的测定包括活细胞、凋亡早期细胞、凋亡晚期细胞和死细胞的含量测定。

在本发明的一种实施方式中，所述缓冲液的pH为5.0-5.8的磷酸盐缓冲液。优选5.0。