[发明专利]一种双光子脱氧核酶金属有机框架探针的制备方法及其应用

权利要求书

1.一种双光子脱氧核酶金属有机框架探针，其特征在于：所述探针包括正八面体的Zr-MOF及Zr-MOF上负载的TP-Zn-ES双链，其中Zr-MOF的直径为201.6±3.8 nm、负载TP-Zn-ES双链的负载量为5.23×10¹⁵；TP-Zn-ES双链是底物链TP-Zn-S和酶链通过杂交制备的；TP-Zn-ES-MOF探针对锌离子的检测限为3.53 nM。

2.权利要求1所述的双光子脱氧核酶金属有机框架探针的制备方法，其特征在于步骤如下：

（1）通过DNA固相合成法将双光子荧光团TP标记到锌离子脱氧核酶底物链的5端，得到底物链TP-Zn-S；

（2）将步骤（1）中的底物链TP-Zn-S和3端标记有BHQ1的酶链混合至Tris缓冲液中，得双链混合物；

（3）将步骤（2）中的双链混合物加热至95℃，然后在冰上退火冷却，得到杂交的TP-Zn-ES双链；

（4）将步骤（3）得到的TP-Zn-ES双链和Zr-MOF悬浊液混合，在室温下孵育、振荡40-60分钟，得混合物；

（5）将步骤（4）得到的混合物离心后得到的沉淀，再用超纯水洗涤3次，将最终得到的沉淀为双光子脱氧核酶金属有机框架探针，即TP-Zn-ES-MOF探针。

3.根据权利要求2所述的双光子脱氧核酶金属有机框架探针的制备方法，其特征在于：所述步骤（1）中底物链TP-Zn-S的序列为5’-TP-ACTCACTAT/rA/GGA AGA GAT GGA CGT GCGACCAGGCCC-3’。

4.根据权利要求2所述的双光子脱氧核酶金属有机框架探针的制备方法，其特征在于：所述步骤（2）中底物链TP-Zn-S和酶链的摩尔比为1：2，酶链BHQ1-Zn-E的序列为5’-GGGCCTGGTCGCACGTCCATCTCTTCTCCGAGCCGGTCGAAATAG-BHQ-1-3’，Tris缓冲液为25 mM Tris、50 mMMgCl₂、100 mM NaCl、pH 7.4。

5.根据权利要求2所述的双光子脱氧核酶金属有机框架探针的制备方法，其特征在于：所述步骤（4）中TP-Zn-ES双链的浓度为1μM，Zr-MOF悬浊液的浓度为1 mg/ mL，其中Zr-MOF的制备方法为，将16.8 mg的ZrCl₄和12 mg的H₂BDC分别溶于4 mL DMF，然后加到50 mL的圆底烧瓶，再向圆底烧瓶中加入2mL DMF至总体积为12mL，在搅拌下将200mL冰醋酸滴加到上述混合物中，在油浴锅中加热至80℃反应12小时，在空气中冷却至室温时，将反应液离心，所得固体用乙醇重复洗涤3次，经真空干燥，得到白色固体粉末即为Zr-MOF。

6.权利要求1所述的双光子脱氧核酶金属有机框架探针在非疾病诊断和治疗为目的的活细胞或凋亡细胞成像中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，在活细胞成像中的应用步骤为：

1）将细胞接种于共聚焦皿中，在37℃、5% CO₂、饱和湿度的细胞培养箱中培养12-24 h，得到培养液A；

2）将TP-Zn-ES-MOF探针加入到步骤1）得到的培养液A中，在37℃、5% CO₂、饱和湿度的细胞培养箱中培养3 h，得到培养液B；

3）分离步骤2）得到的培养液B，用磷酸盐缓冲液冲洗细胞后，加入摩尔比为1:2的锌离子和吡硫钠，孵育30 min；

4）用磷酸盐缓冲液冲洗经步骤3）处理的细胞，之后加入新鲜的不含酚红的细胞培养液，用双光子激光共聚焦显微镜进行拍摄成像。