[发明专利]一种金叶银中杨的创制方法

权利要求书

1.一种金叶银中杨的PaGLK基因，其特征在于，所述PaGLK基因的核苷酸序列如SEQ IDNO：1所示；

所述PaGLK基因的功能为调控叶片颜色。

2.一种由权利要求1所述的金叶银中杨的PaGLK基因编码的蛋白质，其特征在于，所述蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示。

3.一种金叶银中杨表达载体pGLK-RNAi，其特征在于，包含权利要求1所述的PaGLK基因。

4.一种金叶银中杨的创制方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1：提取野生型银中杨的RNA，并以反转录的cDNA为模板，克隆获取如权利要求1所述的PaGLK基因；

步骤2：根据所述PaGLK基因的保守序列设计特异性引物组Ⅰ和特异性引物组Ⅱ，经PCR扩增，分别获取靶向DNA序列和靶向DNA反向互补序列；

步骤3：将pFGC5941载体和所述靶向DNA序列分别用NcoI和AscI酶切后，再用连接酶连接，获取pFGC5941-Cis载体；

将所述pFGC5941-Cis载体和所述靶向DNA反向互补序列分别用XbaI和BamHI酶切后，再用连接酶连接，获取pGLK-RNAi载体；

步骤4：将所述pGLK-RNAi载体采用农杆介导法转化到银中杨中，获得金叶银中杨；

其中，所述特异性引物组Ⅰ包含特异性靶向DNA的正向引物如SEQ ID NO：2所示和反向引物如SEQ ID NO：3所示；所述特异性引物组Ⅱ包含特异性靶向DNA反向互补序列的正向引物如SEQ ID NO：4所示和反向引物如SEQ ID NO：5所示。

5.如权利要求4所述的金叶银中杨的创制方法，其特征在于，所述特异性引物组ⅠPCR用20μL扩增体系：pfu Buffer 2μL、dNTP Mix 2μL、特异性靶向DNA的正向引物0.4μL、特异性靶向DNA的反向引物0.4μL、pfu DNA polymerase 0.4μL、DNA 0.5μL以及余量灭菌水；

扩增程序：95℃1min；95℃20s，55℃20s，72℃1min，40个循环；72℃3min；16℃保温。

6.如权利要求4所述的金叶银中杨的创制方法，其特征在于，所述特异性引物组Ⅱ的PCR用20μL扩增体系：pfu Buffer 2μL、dNTP Mix2μL、特异性靶向DNA反向互补序列的正向引物0.4μL、特异性靶向DNA反向互补序列的反向引物0.4μL、pfu DNA polymerase 0.4μL、DNA0.5μL以及余量灭菌水；

扩增程序：95℃1min；95℃20s，55℃20s，72℃1min，40个循环；72℃3min；16℃保温。

7.如权利要求4所述的金叶银中杨的创制方法，其特征在于，步骤4中所述pGLK-RNAi载体采用农杆介导法转化到银中杨中，其包含以下步骤：

S1：选取银中杨无菌生根苗叶片作为转基因受体，接种至分化培养基，预培养2-3d；

S2：预培养结束前一天，将含所述pGLK-RNAi的工程菌按体积分数为2％接种于含抗菌素的LB培养液中，28℃，180rpm培养过夜，收取培养物并转入无抗菌素的LB培养液中，继续培养3-4h，获取工程菌液；

S3：将S1预培养的叶片用S3所得的工程菌液浸染，再将叶片上菌液吸走后，将所述叶片接种于分化培养基上，共培养2d；

S4：将共培养的叶片转接至选择培养基，进行选择培养，15d后切口处形成抗性愈伤组织；将所述抗性愈伤组织切下并转接到新的选择培养基中继续筛选，25d后获得不定芽；将所述不定芽转接到生根培养基中进行生根培养，15d后长出不定根，即获得转基因银中杨。

8.如权利要求7所述的金叶银中杨的创制方法，其特征在于，S3中所述分化培养基包含以下组分：MS+TDZ 0.1mg/L+NAA 0.02mg/L+蔗糖20g/L+琼脂8g/L；

所述共培养的条件为：28℃黑暗培养。