[发明专利]利用分子伴侣构建的吡喃糖氧化酶基因、蛋白、毕赤酵母菌及制备和应用

说明书

本发明属于新基因的制备及工程菌的构建，特别是指一种利用分子伴侣构建的吡喃糖氧化酶基因、蛋白、毕赤酵母菌及制备和应用。本发明是将毕赤酵母中EroⅠ、PDI、CNE1、SEC53等基因分别克隆连接到毕赤酵母表达载体pPICZ等系列衍生质粒连接，并与P2O共表达转化入Pichia pastoris GS115菌株中，涂布于不同博来霉素浓度梯度YPD平板上考察其效果，通过分子伴侣共表达和发酵条件优化，经筛选鉴定得到一株较原有菌株增强分泌表达吡喃糖氧化酶的菌株，该菌株表达的吡喃糖氧化酶在10L发酵罐上酶活达405U/mL，比没有分子伴侣共表达菌株酶活提高1倍，为吡喃糖氧化酶规模化生产奠定了良好基础。

技术领域

本发明属于新基因的制备及工程菌的构建，特别是指一种利用分子伴侣构建的吡喃糖氧化酶基因、蛋白、毕赤酵母菌及制备和应用。

背景技术

吡喃糖氧化酶(pyranose oxidase,PROD,简称P2O)又名吡喃糖-2-氧化酶或葡萄糖-2-氧化酶(pyranose-2-oxidase,glucose-2-oxidase)，系统编号EC 1.1.3.10，是以黄素蛋白为辅酶、以六元环吡喃单糖类化合物为底物的氧化还原酶类，具有多底物催化特征。该酶属于葡萄糖-甲醇-胆碱氧化还原酶(glucose-methanol-choline oxidoreductases，GMC)家族，可以催化葡萄糖和其他几种吡喃糖C-2位氧化生成相应的2-酮糖，同时将O₂还原为 H₂O₂。吡喃糖氧化酶在糖化学、分析化学和临床化学等行业应用十分广泛。

研究发现，以基因工程菌株异源表达蛋白具有较多优势。工程菌一般遗传背景清楚，培养条件成熟，生长速率较快，蛋白表达调控较易操作。目前，使用较多的异源表达有原核和真核表达系统。经查阅文献发现，到目前为止，吡喃糖氧化酶基因的克隆与表达只在大肠杆菌中进行并成功的实现，如湖南大学的张可可等曾利用大肠杆菌作为宿主菌表达吡喃糖氧化酶，虽能检测到活性(最高0.11U/mL)，但表达量极低。且利用大肠杆菌作为异源表达宿主时，要进行细胞破碎、离心，还经常会遇到包涵体问题，包涵体变性过程容易，而复性却比较复杂，操作不方便。

毕赤酵母表达系统作为一种真核表达系统，具有以下优点：遗传改造方便，外源蛋白表达水平高，真核蛋白翻译后修饰，便于大规模发酵，分泌的重组蛋白易于纯化。毕赤酵母表达系统已经被成功地用来表达多种重组外源蛋白。但是，随着某些外源蛋白的表达水平过高，超过了宿主细胞翻译后处理加工能力所能承担的最大负荷，引起蛋白的错误折叠、不加工或错误定位，进而导致目的蛋白在内质网腔中形成多聚体，并阻滞在内质网妨碍其功能，或者分泌到胞外的蛋白质无活性。这些问题越来越成为阻碍毕赤酵母表达系统应用于高水平表达的瓶颈问题。

分子伴侣是一大类在生物大分子折叠、组装及降解过程中起重要的协同作用，但自身并不发生任何变化的蛋白质分子。不同细胞定位的分子伴侣具有不同的功能。细胞质中的分子伴侣的主要功能是协助蛋白质核糖体转运到内质网膜上，同时分子伴侣之间相互作用，促进错误折叠蛋白多聚体解聚和降解，维护细胞正常的生理代谢状态。内质网膜上的分子伴侣蛋白主要是介导蛋白质核糖体结合到内质网膜上，并组成蛋白质多肽连转运通道，例如 Sec61、Sec62和Sec63组成的转运通道能转运多肽进入内质网腔中。内质网腔中的分子伴侣对保证蛋白质正确折叠具有重要作用。