[发明专利]一种用于改善卵巢早衰的干细胞外泌体复合制剂及其应用

说明书

本发明属于生物学技术领域，具体涉及一种用于改善卵巢早衰的干细胞外泌体复合制剂及其应用。本发明所提供的干细胞外泌体复合制剂由人子宫内膜干细胞外泌体与人脐带间充质干细胞复合组成，选用人子宫内膜干细胞作为干细胞外泌体来源，经培养后收集外泌体，并与一定量的、高活性的人脐带间充质干细胞混合使用，将外泌体和干细胞的功能发挥至最大化，能有效的改善卵巢生理机能，延缓卵巢衰退。本发明还提供了上述干细胞外泌体复合制剂在治疗卵巢早衰、改善激素分泌中的应用。

技术领域

本发明属于生物学技术领域，具体涉及一种用于改善卵巢早衰的干细胞外泌体复合制剂及其应用。

背景技术

卵巢早衰顾名思义指的是女性卵巢功能提前衰退，具体表现为卵巢功能下降的一些症状，如月经周期紊乱、月经量异常、生殖道炎症，还会伴随一系列的更年期症状，如皮肤松弛、易失眠、情绪焦躁等，严重影响妇女的正常生活。目前临床上多见的多囊卵巢综合征，是育龄妇女不孕不育的常见病因，其主要原因就是卵巢功能减弱导致卵泡发育异常，激素代谢紊乱引起的。对于这种疾病，常常采用的是口服或注射激素帮助卵巢短期内恢复排卵功能，但这种方法治标不治本，达不到彻底治愈的效果，病情始终反反复复，给患者带来心理和生理上的困扰。

干细胞是一类具有自我复制能力的多分化潜能的细胞，在一定条件下，可分化为多种功能细胞，且能分泌多种细胞因子，修复组织损伤，调节机体生理功能。已有研究显示，脐带间充质干细胞本身具有归巢属性，一方面可迁移至特定部位，如卵巢和子宫，并在其内存活生长，调控卵巢生理机能，另一方面通过分泌的多种细胞因子，抑制卵巢细胞凋亡，修复受损组织，补偿或替代部分卵巢细胞功能。目前南京鼓楼医院通过注射脐带间充质干细胞修复卵巢早衰，已有成功生产宝宝的案例。

外泌体是近年来备受关注的胞外囊泡，由多种活细胞产生，直径约为30-100nm，可以通过转运蛋白质、RNA、miRNA等介导细胞间物质交换和信息交流，调节细胞微环境、影响细胞生长。已有研究显示，子宫内膜干细胞分泌的外泌体主要通过改善卵巢组织微环境、免疫调节、促进卵泡发育或分化为颗粒细胞，恢复卵巢早衰患者的卵巢功能及生育能力。

发明内容

本发明的目的在于，提供了一种用于改善卵巢早衰的干细胞外泌体复合制剂及其应用，其将子宫内膜干细胞扩大化培养后收集条件培养液，经低温高速离心后获得外泌体，并与一定浓度的人脐带间充质干细胞混合制成复合制剂使用，改善女性卵巢早衰。脐带间充质干细胞通过抑制卵巢细胞凋亡，补偿部分卵巢细胞，改善卵巢机能，并协同外泌体共同作用，改善卵巢内部微环境，从整体上解决卵巢早衰的问题。

为了解决上述问题，本发明提供了一种用于改善卵巢早衰的干细胞外泌体复合制剂及其应用，包括以下步骤：

1)人子宫内膜干细胞培养：选用P2-P8代之间的人子宫内膜干细胞，以1-2×10⁵/cm²密度接种于细胞培养瓶内，加入子宫内膜干细胞培养基培养，待生长至密度为80％-85％时，弃掉原有培养基，磷酸盐缓冲液清洗，换无血清培养基继续培养。

优选的，子宫内膜干细胞培养基为含10％胎牛血清的DMEM/F12；

优选的，弃掉原有培养基后，选用PBS缓冲液清洗细胞表面2-3遍，去除细胞碎片和血清残留；

优选的，无血清培养基为不含任何血清的DMEM/F12培养液；

2)细胞培养液收集：待无血清培养基培养子宫内膜干细胞约48-72h后，无菌收集细胞培养液，过滤除菌后，-20℃保存。

优选的，收集的细胞培养液需经过0.22μm孔径的滤器过滤，收取滤液保存。

3)外泌体的提取及浓度测定：将步骤2)中得到的细胞培养液经过低温高速离心后，取沉淀，用3-5mL盐水悬浮，留少量液体做浓度检测，其余液体冷藏备用。